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線粒體檸檬酸（Mitochondrion citric acid, MCA）含量

試劑盒說明書

 微量法 100 管/96 樣

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

MCA是線粒體三羧酸循環(huán)的一個中間產(chǎn)物,，由檸檬酸合酶催化乙酰CoA與草酰乙酸合成，

其含量是三羧酸循環(huán)強度的主要指標之一,。

配合測定丙酮酸含量,、丙酮酸脫氫酶活性、乙酰 CoA 含量,、檸檬酸合酶活性和 MCA 含量，

其中（1）丙酮酸含量和丙酮酸脫氫酶活性變化可以反映糖酵解進行程度,，（2）綜合分析丙

酮酸含量,、丙酮酸脫氫酶活性和乙酰 CoA 含量變化可以反映脂肪酸β-氧化途徑提供的乙酰

CoA 情況，（3）乙酰 CoA 含量,、檸檬酸合酶活性和 MCA 含量變化可以反映三羧酸循環(huán)進

行狀況,。

測定原理：

MCA 在檸檬酸裂解酶的作用下，生成α-酮酸（草酰乙酸）,；在弱酸性條件下,，α-酮酸進一

步與苯肼反應(yīng)，生成相應(yīng)的α-酮酸苯腙,；α-酮酸苯腙在 330nm 處有吸收峰,，該波長下吸光

度的變化程度可反映出 MCA 的含量。

自備儀器和用品：

分光光度計/酶標儀、水浴鍋,、可調(diào)式移液槍,、微量石英比色皿/96 孔板（UV 板）、研缽,、蒸

餾水,。

試劑組成和配制：

酸性提取液：液體 100mL×1 瓶，4℃保存,。

堿性提取液：液體 100mL×1 瓶,，4℃保存。

試劑一：液體 6mL×1 瓶,，4℃保存,。

試劑二：液體 2mL×1 瓶，4℃保存,。

試劑三：粉劑×1 瓶,，4℃保存；臨用前加入 6mL 蒸餾水充分溶解待用,；用不完的試劑 4℃保

存,；

標準液：液體 1mL×1 支，10μmol/mL 檸檬酸標準液,，4℃保存,。

線粒體中檸檬酸提取：

稱 0.05~0.1g 樣品（建議稱 0.1g 樣本）,，加入 0.5mL 酸性提取液,，冰上充分研磨，600g/min 4℃

離心 5min,；取上清至另一 EP 管中,，11000g/min 4℃離心 10min，棄上清（取 300μL 該上清

液和 300μL 堿性提取液中和后可用于細胞質(zhì) CA 含量測定）,；沉淀即線粒體,，向沉淀中加

入 0.5mL 酸性提取液，充分懸浮溶解,，超聲波破碎（功率 20％,，超聲 3 秒，間隔 10 秒,，重

復(fù) 30 次）,，取此溶液 300μL 和 300μL 堿性提取液中和，混勻,，置冰上待測（不可用于蛋

白質(zhì)含量測定）,。

測定步驟：

1,、分光光度計或酶標儀預(yù)熱 30 min 以上，調(diào)節(jié)波長到 330nm,，蒸餾水調(diào)零,。

2、試劑一,、二和三 37℃預(yù)熱 10min,。

3、樣本測定：

空白管和標準管只需要各做一個,。

試劑名稱(μL) 空白管 標準管 測定管

試劑一 60 60 60

蒸餾水 60

標準液 60

樣本 60

試劑二 20 20 20

試劑三 60 60 60

充分混勻,，330nm 立即測定初始吸光值 A1 和 37℃孵育 30min 后的吸光值 A2，ΔA=A2 –A1,。

檸檬酸含量計算：

（1）按蛋白濃度計算

檸檬酸含量(μmol/mg prot)=[C 標準管×(ΔA 測定管－ΔA 空白管)÷(ΔA 標準管－ΔA 空白管)

×V 樣]÷（V 樣÷Cpr）=10×(ΔA 測定管－ΔA 空白管)÷(ΔA 標準管－ΔA 空白管)÷Cpr

蛋白質(zhì)含量需要另外測定,。

（2）按樣本鮮重計算

檸檬酸含量(μ mol/g鮮重)=[C標準管×(ΔA測定管－ΔA空白管)÷(ΔA標準管－ΔA空白管) ×V

樣]÷（W×V 樣÷V 樣總）=10×(ΔA 測定管－ΔA 空白管)÷(ΔA 標準管－ΔA 空白管)÷W

C 標準管：標準液濃度，10μmol/mL,； V 樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積：0.06mL,；V 樣總：

加入提取液體積：1mL；Cpr：樣品蛋白濃度,，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量，g,。

注意：檢測限為 10nmol/mg prot 或 1μmol/g 鮮重,。