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注意：正式測定之前選擇2-3個預期差異大的樣本做預測定,。

　　測定意義：

　　NP在一定的溫度和中性pH條件下，催化水解蛋白質。由于其安全無毒,、水解能力強、作用范圍廣等特點，中性蛋白酶常用于食品,、飼料,、化妝品和營養(yǎng)保健品生產。

　　測定原理：

　　中性條件下,，NP催化酪蛋白水解產生酪氨酸,；在堿性條件下，酪氨酸還原磷鉬酸化合物生成鎢藍,；在680nm有特征吸收峰,。

　　自備儀器和用品：

　　可見分光光度計/酶標儀、微量玻璃比色皿/96孔板,、水浴鍋,、磁力攪拌器、可調式移液槍,、1.5mL EP管和蒸餾水,。

　　試劑組成和配制：

　　試劑一：液體×1 瓶，4℃保存,。

　　試劑二：粉劑×1 瓶,，4℃保存。臨用前加4mL蒸餾水溶解,。

　　試劑三：粉劑×1 瓶,，4℃避光保存。臨用前加入4mL試劑一,，沸水浴中磁力攪拌溶解,。

　　試劑四：粉劑×1 瓶，4℃保存,。臨用前加20mL蒸餾水溶解,。

　　試劑五：液體×1 瓶，4℃保存,。

　　標準品：液體×1 支,，0.25μmol/mL 標準酪氨酸溶液，4℃保存,。

　　粗酶液提?。?/p>

　　1. 組織：按照組織質量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）冰浴勻漿,，8000g,，4℃離心10min，取上清,，即粗酶液,。

　　2. 血清或培養(yǎng)液：直接測定,。

　　3. 細菌、真菌：按照細胞數(shù)量（104個）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL試劑一）,，冰浴超聲波破碎細胞（功率300w,，超聲3秒，間隔7秒,，總時間3min）,；然后8000g，4℃,，離心10min,，取上清置于冰上待測。

　　測定操作：

　　1.分光光度計/酶標儀預熱30min,，調節(jié)波長到680nm,，蒸餾水調零。

　　2.試劑二,、試劑三和試劑四置于30℃水浴保溫30min,。

　　3.對照管：取0.5mL EP管，加入20μL粗酶液,，40μL試劑二,，混勻后置于30℃水浴保溫10min；加入40μL試劑三,，混勻后8000g,，4℃離心10min；取40μL上清液,，加入新的EP管,，再加入200μL試劑四，40μL試劑五,，混勻后置于30℃水浴保溫20min,，取200μL于微量玻璃比色皿/96 孔板,，于680nm測定光吸收,，記為A對照管。

　　4.測定管：取0.5mL EP管,，加入20μL粗酶液,，40μL試劑三，混勻后置于30℃水浴保溫10min,；加入40μL試劑二,，混勻后10000rpm 4℃離心10min；取40μL上清液,，加入新的EP管,，再加入200μL試劑四,，40μL試劑五，混勻后置于30℃水浴保溫20min,，取200μL于微量玻璃比色皿/96 孔板,，于680nm測定光吸收，記為A測定管,。（注意與空白管不同,，先加試劑三，后加試劑二）

　　5.空白管：取0.5mL EP管,，加入40μL蒸餾水,，200μL試劑四，40μL試劑五,，混勻后置于30℃水浴保溫20min,，取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板，于680nm測定光吸收,，記為A空白管,。

　　6.標準管：取0.5mL EP管，加入40μL標準品,，200μL試劑四,，40μL試劑五，混勻后置于30℃水浴保溫20min,，取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板,，于680nm測定光吸收，記為A標準管,。

　　注意：空白管和標準管只需要測定一次,。

　　計算公式：

　　a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

　　（1）按蛋白濃度計算

　　NP活性單位定義：30℃每毫克蛋白每分鐘水解產生1nmol酪氨酸為1個酶活單位,。

　　NP活性（nmol/min/mg prot）= C標準品×（A測定管－A對照管）÷（A標準管－A空白管）×稀釋倍數(shù)÷（Cpr×V1）÷T= 3125×（A測定管－A對照管）÷（A標準管－A空白管）÷Cpr

　?。?）按樣本質量計算

　　NP活性單位定義：30℃每克樣品每分鐘催化水解產生1nmol酪氨酸為1個酶活單位。

　　NP活性（nmol/min /g）=C標準品×（A測定管－A對照管）÷（A標準管－A空白管）×稀釋倍數(shù)÷（W×V1÷V2）÷T= 3125×（A測定管－A對照管）÷（A標準管－A空白管）÷W

　?。?）按照液體體積計算

　　NP活性單位定義：30℃每毫升樣品每分鐘催化水解產生1nmol酪氨酸為1個酶活單位,。

　　NP活性（nmol/min/mL）=C 標準品×（A測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白管）×稀釋倍數(shù)÷V1÷T= 3125×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白管）

　　（4）按照細胞數(shù)量計算

　　NP活性單位定義：30℃每104個細胞每分鐘催化水解產生1nmol酪氨酸為1個酶活單位,。

　　NP活性（nmol/min /104cell）=C 標準品×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白管）×稀釋倍數(shù)÷（細胞數(shù)量×V1÷V2）÷T= 3125×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白管）÷細胞數(shù)量

　　C 標準品：0.25 μmol/mL 標準酪氨酸溶液,；稀釋倍數(shù)：（20+40+40）÷40=2.5；Cpr：粗酶液蛋白質濃度（mg/mL）,，注意該粗酶液不能直接用于蛋白質含量測定,，需要另外測定；建議

　　稱取同樣質量的樣品,，加入1mL 蒸餾水勻漿提取離心后,，用本公司蛋白質含量測定試劑盒

　　測定,；W：樣品質量（g）；V1：加入反應體系中粗酶液體積（mL）,，20μL=2×10 -2mL,；V2：

　　粗酶液總體積（mL），1mL,；T：催化反應時間（min）,，10min。

　　b.使用96 孔板測定的計算公式如下

　?。?）按蛋白濃度計算

　　NP活性單位定義：30℃每毫克蛋白每分鐘水解產生1nmol酪氨酸為1個酶活單位,。

　　NP活性（nmol/min /mg prot）= C 標準品×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白管）×稀釋倍數(shù)÷（Cpr×V1）÷T= 3125×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白管）÷Cpr

　　（2）按樣本質量計算

　　NP活性單位定義：30℃每克樣品每分鐘催化水解產生1nmol酪氨酸為1個酶活單位,。

　　NP活性（nmol/min/g）=C標準品×（A測定管－A對照管）÷（A標準管－A空白管）×稀釋倍數(shù)÷（W×V1÷V2）÷T= 3125×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白管）÷W

　?。?）按照液體體積計算

　　NP活性單位定義：30℃每毫升樣品每分鐘催化水解產生1nmol酪氨酸為1個酶活單位。

　　NP活性（nmol/min/mL）=C 標準品×（A測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白管）×稀釋倍數(shù)÷V1÷T= 3125×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白管）

　?。?）按照細胞數(shù)量計算

　　NP活性單位定義：30℃每104個細胞每分鐘催化水解產生1nmol酪氨酸為1個酶活單位,。

　　NP活性（nmol/min /104cell）=C 標準品×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白管）×稀釋倍數(shù)÷（細胞數(shù)量×V1÷V2）÷T= 3125×（A 測定管－A 對照管）÷（A 標準管－A 空白管）÷細胞數(shù)量

　　C 標準品：0.25 μmol/mL 標準酪氨酸溶液；稀釋倍數(shù)：（20+40+40）÷40=2.5,；Cpr：粗酶液蛋白質濃度（mg/mL）,，注意該粗酶液不能直接用于蛋白質含量測定，需要另外測定,；建議

　　稱取同樣質量的樣品,，加入1mL 蒸餾水勻漿提取離心后，用本公司蛋白質含量測定試劑盒測定,；W：樣品質量（g）,；V1：加入反應體系中粗酶液體積（mL），20μL=2×10-2mL,；V2：粗酶液總體積（mL）,，1mL；T：催化反應時間（min）,，10min,。

　　注意事項：

　　臨用前配制的試劑配制好后4℃保存，并且3 天內使用完畢,。