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貨號：YX-W-A702 規(guī)格：100 管/48 樣

ATP含量試劑盒說明書

微量法

正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

ATP廣泛存在于動物,、植物,、微生物和培養(yǎng)細胞中,，是生物能量通貨,，能荷是描述細胞能量代謝狀態(tài)的主要參數(shù),。測定ATP含量并且計算能荷,，能夠反映能量代謝狀態(tài),。

測定原理：

肌酸激酶催化肌酸和ATP反應(yīng)生成磷酸肌酸，可在700nm下用磷鉬酸比色法檢測磷酸肌酸含量,，以此反應(yīng)ATP含量,。

自備儀器和用品：

分光光度計/酶標儀、水浴鍋,、可調(diào)式移液槍,、微量石英比色皿/96孔板、研缽和蒸餾水,。

試劑組成和配制：

酸性提取液：液體 60mL×1 瓶,，4℃保存； 堿性提取液：液體 60mL×1 瓶,，4℃保存,；

試劑一：粉劑×1 支，4℃保存,；臨用前加入 1mL 蒸餾水充分溶解待用,；用不完的試劑 4℃ 保存；

試劑二：液體 1.5mL×1 支,，4℃保存,；

試劑三：粉劑×1 瓶,，4℃保存；臨用前加入 500μL 蒸餾水充分溶解待用,；用不完的試劑 4℃保存一周,；

試劑四：液體 5mL×1 瓶，4℃保存,； 試劑五：液體 25mL×1 瓶,，4℃保存；

標準液：液體 10mL×1 瓶,，2μmol/mLATP 標準液,，4℃保存；

ATP 提?。?/p>

1,、血清（漿）中ATP的提取：按照血清（漿）體積（mL）：酸性提取液體積（mL）為 1：5~10 的比例（建議取約0.1mL血清（漿）,，加入1mL酸性提取液）,，進行冰浴勻漿，8000g 4℃離心 10min,；取上清液至另一EP管中,，加入等體積的堿性提取液使之中和，混勻,，8000g4 ℃ 離心 10min,，取上清，置冰上待測（不可用于蛋白質(zhì)含量測定）,。

2,、組織中 ATP 的提取：按照組織質(zhì)量（g）：酸性提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織,，加入1mL酸性提取液）,，進行冰浴勻漿，8000g 4℃離心10min,，取上清至另一EP管中,，加入等體積的堿性提取液使之中和，混勻,，8000g 4℃離心10min,，取上清，置冰上待測（不可用于蛋白質(zhì)含量測定）,。

3,、細胞或細菌中ATP的提取：先收集細胞或細菌到離心管內(nèi)，棄上清,，按照細菌或細胞數(shù)量（104 個）：酸性提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議500萬細菌或細胞加入1mL 酸性提取液）,，超聲波破碎1min（冰浴，強度20％或200W,，超聲2s,，停1s），8000g 4 ℃離心10min,；取上清液至另一EP管中,，加入等體積的堿性提取液使之中和，混勻,，8000g 4℃ 離心 10min,，取上清，置冰上待測（不可用于蛋白質(zhì)含量測定）,。

 

 

測定步驟：

1,、分光光度計或酶標儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長到700nm,，蒸餾水調(diào)零,。

2、顯色劑的配制：臨用前請根據(jù)擬用顯色劑體積（樣本數(shù)×0.2 mL）,，按試劑四(mL)：試劑五（mL）=1：5 的比例配制,。用多少配多少。

3,、樣本測定：

試劑名稱(μL) 測定管 對照管 標準管 空白管

樣本    10 10

標準液 10 10

試劑一   20 20

試劑二   10 10 10 10

試劑三   10 10

蒸餾水 30 30

充分混勻,，37℃準確水浴 30min

顯色劑 200 200 200 200

37℃水浴20min后，700nm下測定各管吸光值

注意 ：空白管和標準管通常只需要各做一個,。每個測定管設(shè)一個對照管,。

ATP 含量計算：

1,、血清（漿）中ATP含量計算

ATP含量(μmol/mL)=[C標準管×(A測定管－A對照管)÷(A標準管－A空白管)×V1]÷(V3×V1÷ V2)=40×(A測定管－A對照管)÷(A標準管－A空白管)

2,、組織、細菌或細胞中ATP含量計算

（1）按蛋白濃度計算

ATP含量(μmol/mg prot)=[C標準管×(A測定管－A對照管)÷(A標準管－A空白管)×V1]÷(V1÷ Cpr）=2×(A測定管－A對照管)÷(A標準管－A空白管)÷Cpr

蛋白質(zhì)含量需要另外測定,。

（2）按樣本鮮重計算

ATP含量（μmol/g 鮮重)=[C標準管×(A測定管－A對照管)÷(A標準管－A空白管)×V1]÷(W×V1÷ V2)=4×(A測定管－A對照管)÷(A標準管－A空白管)÷W

（3）按細菌或細胞密度計算

ATP含量(μmol/104cell）=[C標準管×(A測定管－A對照管)÷(A標準管－A空白管)×V1]÷(500× V1÷V2)=0.008×(A測定管－A對照管)÷(A標準管－A空白管)÷W

C 標準管：標準液濃度,，2μmol/mL；V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積,，0.01mL,；V2：加入提取液體積，2mL,；V3：加入血清（漿）體積：0.1mL,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL； W：樣本質(zhì)量,， g,；500：細胞或細菌總數(shù)，500 萬,。

注意：蕞低檢測限為 10nmol/mL 或10nmol/g鮮重或 0.1nmol/mg prot