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古典豬瘟病毒檢測試劑盒（實(shí)時(shí)熒光PCR法）說明書
閱讀：368 發(fā)布時(shí)間：2020-10-14
【產(chǎn)品名稱】
通用名稱：古典豬瘟病毒檢測試劑盒（實(shí)時(shí)熒光PCR法）
英文名稱：Classieal Swine Fever virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包裝規(guī)格】 25T/盒 & 50T/盒
【預(yù)期用途】
本試劑盒適用于古典豬瘟病毒檢測,，可用于臨床古典豬瘟病毒感染的輔助診斷，但不作確診使用,。
【檢驗(yàn)原理】
本試劑盒針對古典豬瘟病毒的高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物和探針,，在反應(yīng)體系中含古典豬瘟病毒基因組模板的情況下，PCR反應(yīng)得以進(jìn)行并釋放熒光信號,。利用熒光定量PCR儀對PCR過程中相應(yīng)通道信號進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測和輸出,，實(shí)現(xiàn)檢測結(jié)果的定性分析,。
【主要組成成份】
序號 | 組成 | 25T/盒 | 50T/盒 |
1 | CSFV RT-PCR反應(yīng)液 | 375 μL×1管 | 750 μL×1管 |
2 | CSFV逆轉(zhuǎn)錄酶 | 50 μL×1管 | 100 μL×1管 |
3 | CSFV Taq酶 | 75 μL×1管 | 150 μL×1管 |
4 | CSFV陽性對照 | 40 μL×1管 | 40 μL×1管 |
5 | CSFV陰性對照 | 40 μL×1管 | 40 μL×1管 |
6 | 說明書 | 1份 | 1份 |
注：陰性對照為豬基因組DNA,，陽性對照為失去活性的古典豬瘟病毒cDNA,。
【儲存條件及有效期】避光-20℃以下保存，避免反復(fù)凍融,，有效期12個(gè)月。
【適用儀器】ABI 系列,、Bio-Rad系列,、Agilent Stratagene MX系列 、Roche LightCycler R480,、Cepheid SmartCycler,、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀,。
【樣本要求】
1.血液或血清樣品：使用無菌注射液抽取樣品置于離心管中待檢,。
2.肌肉或內(nèi)臟樣品：取少量樣品（2～3克）于研缽或勻漿器中研磨，然后將研磨勻漿轉(zhuǎn)入無菌離心管中,，3000rpm/min 離心10分鐘取上清待檢,。
3.應(yīng)避免標(biāo)本間交叉污染。
4.標(biāo)本收集后可立即檢測,；若不能立即檢測,，可置于2～8℃冷藏過夜保存；如需長期保存,，標(biāo)本應(yīng)凍存于-80℃以下,，避免反復(fù)凍融。
【檢驗(yàn)方法】
1. 試劑準(zhǔn)備（試劑準(zhǔn)備區(qū)）
（1）從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實(shí)驗(yàn)所需試劑,充分融化混勻并瞬時(shí)離心以去除管壁附著液體,。
（2）核算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的反應(yīng)數(shù)（n）,，并根據(jù)如下表所示反應(yīng)體系計(jì)算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的各種試劑量。
n =陰性對照數(shù)（1T）+陽性對照數(shù)（1T）+誤差預(yù)留量（1T）+樣本數(shù)
單反液配制表(每份) | RT-PCR反應(yīng)液 | 15.0 μL |
逆轉(zhuǎn)錄酶 | 2.0 μL | |
Taq酶 | 3.0 μL |
(3)在無菌離心管中加入上述試劑,，充分混勻后瞬時(shí)離心,。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應(yīng)管。
2.樣本準(zhǔn)備（樣本處理區(qū)）
用QIAGEN,、Roche公司RNA提取試劑盒提取RNA,，具體操作按照其試劑盒說明書操作。
3.加樣
在上述制備好的PCR反應(yīng)樣本管中分別加入處理好的待測標(biāo)本RNA各5 μl,、終體積25 μl/管,，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時(shí)低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上,。陰性對照和陽性對照管則各加5 μL試劑盒自帶的陰性對照或陽性對照品,，終體積為25 μl/管,，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時(shí)低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上,。
4. PCR（PCR擴(kuò)增區(qū)）
（1）取樣本處理區(qū)準(zhǔn)備好的PCR反應(yīng)管,，放置在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀樣品槽相應(yīng)位置，并記錄放置順序,。
（2）按下表設(shè)置儀器核酸擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,。
反應(yīng)體積 | 25 μL | 通道選擇 | FAM通道采集古典豬瘟病毒熒光信號 |
PCR 反應(yīng) 條件 | 步驟 | 條件 | 循環(huán)數(shù) |
反轉(zhuǎn)錄 | 42℃：10分鐘（min） | 1 | |
預(yù)變性 | 95℃：3分鐘（min） | 1 | |
預(yù)擴(kuò)增 | 95℃：5秒（s） | 5 | |
55℃：40秒（s） | |||
PCR擴(kuò)增 | 95℃：5秒（s） | 40 | |
55℃：40秒（s） （此階段結(jié)束時(shí)采集熒光信號） |
注：ABI系列熒光PCR儀在設(shè)置時(shí)不選ROX校正，設(shè)置淬滅基團(tuán)選擇None,。
【參考值（參考范圍）】
1.試劑盒有效性判定：
（1）陽性對照：有典型S型擴(kuò)增曲線或Ct值≤35,。
（2）陰性對照：Ct值＞38或無Ct值，線形為直線或輕微斜線,，無指數(shù)增長期,。
2.標(biāo)本結(jié)果判定：
（1）陽性：標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值≤35或有明顯指數(shù)增長期。
（2）可疑：標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值在35～38范圍內(nèi),。此時(shí)應(yīng)對標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)檢測,，如重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Ct值仍在35～38范圍內(nèi)，有明顯指數(shù)增長期,，則判定為陽性,，否則為陰性。
（3）陰性：標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值＞38或無Ct值,。
【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】
通道及檢測結(jié)果 | 標(biāo)本檢測結(jié)果解釋 |
FAM | |
陽性（＋） | 標(biāo)本中檢出古典豬瘟病毒RNA |
陰性（－） | 標(biāo)本中未檢出古典豬瘟病毒RNA |
【檢驗(yàn)方法的局限性】
- 當(dāng)檢測樣本中被檢核酸濃度低于本試劑盒的低檢出*可能會(huì)發(fā)生假陰性的結(jié)果,。
- 被檢樣本在采集、運(yùn)輸,、儲存以及處理過程中操作方式不當(dāng)容易造成RNA降解而產(chǎn)生假陰性結(jié)果,。
- 樣本在采集、運(yùn)輸,、儲存以及處理過程中發(fā)生交叉污染,，則容易得到假陽性結(jié)果。
【產(chǎn)品性能指標(biāo)】 產(chǎn)品的低檢出限為102 Copies/mL,，產(chǎn)品CV值≤5%,。
【注意事項(xiàng)】
- 整個(gè)檢測過程應(yīng)嚴(yán)格按照本說明書要求分別在試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本處理區(qū)和PCR擴(kuò)增區(qū)進(jìn)行操作,，各區(qū)實(shí)驗(yàn)服,、儀器、耗材應(yīng)獨(dú)立使用,，不能混用,；實(shí)驗(yàn)用吸頭采用帶濾芯吸頭；樣本處理區(qū)應(yīng)配有生物安全柜，樣本處理在生物安全柜中進(jìn)行操作,；三個(gè)區(qū)應(yīng)該配有紫外線殺菌裝置,。
- 為避免RNA降解，樣本處理過程應(yīng)在0-4℃條件下操作,，且完成實(shí)驗(yàn)后立即上機(jī)檢測,；樣本處理過程中使用的器具耗材應(yīng)經(jīng)過無核酶處理。
- 每次實(shí)驗(yàn)應(yīng)該設(shè)置陰,、陽性對照,。
- 試劑盒所有試劑在使用前應(yīng)該在常溫下充分融化混勻，并應(yīng)瞬時(shí)離心,。
- 試劑盒內(nèi)所配陰性和陽性對照在一次使用前應(yīng)全部轉(zhuǎn)移至標(biāo)本準(zhǔn)備區(qū),，并單獨(dú)存放。
- 為防止熒光干擾,，應(yīng)避免裸手直接接觸PCR反應(yīng)管，并應(yīng)避免在PCR反應(yīng)管上進(jìn)行任何標(biāo)記,。
- 儀器擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)應(yīng)按照本說明書相關(guān)要求進(jìn)行設(shè)置,；不同批號試劑不能混用。
- ABI系列熒光定量PCR儀參數(shù)設(shè)置中不選ROX校正,，淬滅基因選擇None,。
- 實(shí)驗(yàn)過程中產(chǎn)品的廢棄物應(yīng)該進(jìn)行無害化處理后方可丟棄。