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免疫共沉淀（Co-IP）試驗
閱讀：648 發(fā)布時間：2020-10-12
免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,，CoIP）是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法，用于確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用。
其原理是：當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來,。如果用蛋白質(zhì)x的抗體免疫沉淀x，那么與x在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)y也能沉淀下來,。目前多用精制的prorein A預(yù)先結(jié)合固化在argarose的beads上,，使之與含有抗原的溶液及抗體反應(yīng)后，beads上的prorein A就能吸附抗原達(dá)到精制的目的,。這種方法常用于測定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合,；也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔。
一,、免疫共沉淀的優(yōu)點
1. 相互作用的蛋白質(zhì)都是經(jīng)翻譯后修飾的,，處于天然狀態(tài)。
2. 蛋白的相互作用是在自然狀態(tài)下進(jìn)行的,，可以避免人為的影響,。
3. 可以分離得到天然狀態(tài)的相互作用蛋白復(fù)合物。
二,、免疫共沉淀的缺點
1. 可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用；
2. 兩種蛋白質(zhì)的結(jié)合可能不是直接結(jié)合,，而可能有第三者在中間起橋梁作用,；
3. 必須在實驗前預(yù)測目的蛋白是什么，以選擇后檢測的抗體,，所以,，若預(yù)測不正確，實驗就得不到結(jié)果,，方法本身具有冒險性,。
一、試劑準(zhǔn)備
1. 預(yù)冷PBS,，RIPA Buffer,，細(xì)胞刮子（用保鮮膜包好后，埋冰下）,，離心機(jī),。
2. 用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞兩次，后一次吸干PBS,。
3. 加入預(yù)冷的RIPA Buffer(1 ml/107個細(xì)胞,、10 cm培養(yǎng)皿或150 cm2培養(yǎng)瓶，0.5 ml/5x106個細(xì)胞,、6 cm培養(yǎng)皿,、75 cm2培養(yǎng)瓶）。
4. 用預(yù)冷的細(xì)胞刮子將細(xì)胞從培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶上刮下，把懸液轉(zhuǎn)到1.5EP管中,，4℃,，緩慢晃動15 min（EP管插冰上，置水平搖床上）,。
5. 4℃,，14000 g離心15 min，立即將上清轉(zhuǎn)移到一個新的離心管中,。
6. 準(zhǔn)備Protein A agarose,，用PBS 洗兩遍珠子，然后用PBS配制成50%濃度,，建議減掉槍尖部分,，避免在涉及瓊脂糖珠的操作中破壞瓊脂糖珠。
7. 每1 ml總蛋白中加入100 ul Protein A瓊脂糖珠（50%）,，4℃搖晃10 min（EP管插冰上,，置水平搖床上），以去除非特異性雜蛋白,，降低背景,。
8. 4℃，14000 g離心1 5min,，將上清轉(zhuǎn)移到一個新的離心管中,，去除Protein A珠子。
9． （Bradford 法）做蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線,，測定蛋白濃度,，測前將總蛋白至少稀釋1：10倍以上，以減少細(xì)胞裂解液中去垢劑的影響（定量,，分裝后,，可以在-20℃保存一個月）。
10. 用PBS將總蛋白稀釋到約1 ug/ul,，以降低裂解液中去垢劑的濃度,，如果興趣蛋白在細(xì)胞中含量較低，則總蛋白濃度應(yīng)該稍高（如10 ug/ul）,。
11. 加入一定體積的兔抗到500 ul總蛋白中,，抗體的稀釋比例因興趣蛋白在不同細(xì)胞系中的多少而異。
12. 4℃緩慢搖動抗原抗體混合物過夜或室溫2h,，激酶或磷酸酯酶活性分析建議用2 h室溫孵育,。
13. 加入100 ul Protein A瓊脂糖珠來捕捉抗原抗體復(fù)合物，4℃緩慢搖動抗原抗體混合物過夜或室溫1 h,，如果所用抗體為鼠抗或雞抗,，建議加2 ul "過渡抗體"（兔抗鼠IgG,，兔抗雞IgG）。
14. 14000 rpm瞬時離心5 s,，收集瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物,，去上清，用預(yù)冷的RIPA buffer洗3遍,，800 ul/遍,，RIPA buffer有時候會破壞瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物內(nèi)部的結(jié)合，可以使用PBS,。
15. 用60 ul 2x上樣緩沖液將瓊脂糖珠-抗原抗體復(fù)合物懸起,，輕輕混勻，緩沖液的量依據(jù)上樣多少的需要而定（60 ul足夠上三道）,。
16. 將上樣樣品煮5 min,，以游離抗原，抗體,，珠子,，離心，將上清電泳,，收集剩余瓊脂糖珠,，上清也可以暫時凍-20℃，留待以后電泳,，電泳前應(yīng)再次煮5 min變性,。