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細胞凍存實驗
閱讀：512 發(fā)布時間：2020-9-28| 實驗方法原理 | 細胞生長至對數(shù)晚期，以培養(yǎng)基制備高濃度細胞懸液,，加入細胞保護劑,，等份轉(zhuǎn)移至凍存管中，緩慢冷凍,。
細胞凍存時向培養(yǎng)基中加入保護劑,，即終濃度5%.15%的甘油或二甲基亞砜（DMSO），可使溶液冰點降低,，加之在緩慢凍結(jié)條件下,，細胞內(nèi)水分透出，減少了冰晶形成,，從而避免細胞損傷,。 采用"慢凍快融"的方法能較好地保證細胞存活。標準冷凍速度開始為-1 到 -2℃/min,，當溫度低于-25℃時可加速,，到-80℃之后可直接投入液氮內(nèi)（-196℃）,。
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| 實驗材料 | 細胞 |
| 試劑、試劑盒 | 胰蛋白酶 BSS DMSO |
| 儀器,、耗材 | 吸管 離心管 玻璃安瓿 酒精燈 線繩 紗布口袋 搪瓷罐 |
| 實驗步驟 | 1. 肉眼及顯微鏡觀察,，確保細胞滿足冷凍標準。
2.使細胞生長至對數(shù)生長晚期,，若為貼壁細胞,，用胰酶消化，并進行細胞技數(shù),。若為懸浮生長細胞,，進行細胞計數(shù)并離心。
3.懸浮細胞的濃度為：2×106個~2×107個細胞/ml,。
4.將以下任意一種細胞保護劑加入到生長培養(yǎng)基中,，配制凍存液： （a） 加10%~20%的二甲基亞砜（DMSO）或（b）加20%~30%甘油。
5. 用凍存液將細胞懸液按1：1的比例稀釋至細胞度濃約為1×106 ~1×107 /ml ,此時DMSO的濃度為5%-10%（或甘油濃度為10-15%）,。建議勿將凍存管置于冰上,，減少細胞退化。使用DMSO時,，室溫操作30min是無害的,，當使用甘油時，則對細胞是有益的,。
6. 將細胞懸液分裝至預先標記好的凍存管中,，蓋上蓋子，擰緊,，密封,，注意不要太緊，避免螺旋扭曲變形,。
7. 將凍存管夾在鋁條上，裝入儲存筒中,，或?qū)⑵渌缮⒌嘏帕性诔閷蟽Υ嫫髦小?/p>
8. 將凍存管通過上述方法之一以1℃/min的速率進行冷凍,。使用隔熱保溫的方法，使凍存管達到-70℃,，若初溫度為20℃,，則需4~6h，但好于-70℃過夜,。
9.當凍存管溫度達到-70℃或更低時,，在將其從-70℃或能控制冷凍速率的冷凍柜中轉(zhuǎn)移出來之前，檢查冷凍記錄,，確定液氮罐中存放凍存管的合適位置,。
10. 將凍存管轉(zhuǎn)移至液氮冷凍罐中,，好不要使其浸沒在液氮中，將放油凍存管的鋁條和紙質(zhì)管放入預先確定的儲存筒中,，或?qū)€別凍存管放入預先確定的抽屜中,。該步驟必須迅速（＜2min），因為凍存管會以越10℃/min的速度升溫,，如果溫度上升超過-50℃,，細胞會迅速惡化。 |
| 注意事項 | 1.二甲基亞砜能穿透許多合成的或天然的膜,，包括皮膚和橡膠手套 ,。因此，應謹慎處理,。
2.將凍存管放入液氮時,，必須使用保護性手套和面罩。
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| 其他 | 1. 為保持細胞大存活率,，一般都采用慢凍存融的方法,。 2. 凍存物距液氮面越近溫度越低。標準的低凍速度為－1℃~12℃/分鐘,，當溫度下降達－25℃時,，下降速度可增至－5~－10℃/分鐘，到－100℃時則可迅速凍入液氮中,。因此要適當掌握凍存物下降入液氮中的速度,，過快能影響細胞內(nèi)水分透出，太慢則促冰晶形成,。 3. 初次凍存者在下降凍存時,，宜先用細木棒伸入罐中探測液面位置，然后需用溫度計與凍存物并行的辦法,，以觀測下降凍存物的速度,、凍存物與液氮液面距離和溫度三者關(guān)系，當已掌握以上各參數(shù)和凍存技術(shù)熟練后,，僅按下降時間和下降距離便可獲理想凍存效果,。 4. 各種細胞對凍存速度的要求也不一樣；上皮細胞和成纖維細胞耐受性可能大些,，骨髓干細胞－2~－3℃/分鐘合適,；胚胎細胞耐受性較小，不宜太快,?？傊谝婚_始時，下降速度不能超過－10℃/分鐘。 5. 用什么防護劑合適和用量多大,，要依細胞而定,，初代培養(yǎng)細胞用DMSO 較好，一般細胞可用甘油,；用量以較小為好,。有人認為人皮膚上皮細胞貯存在20%-30%甘油中很好。 6. 原則上細胞在液氮中可貯存多年,，但為妥善起見,，凍存一年后，應再復蘇培養(yǎng)一次,，然后再繼續(xù)凍存,。 |