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單細(xì)胞染色質(zhì)開放性圖譜帶你認(rèn)識(shí)器官發(fā)生的分子調(diào)控機(jī)制
閱讀：255 發(fā)布時(shí)間：2020-9-27在哺乳動(dòng)物胚胎發(fā)育的過程中,，多能細(xì)胞迅速分裂分化，但是每個(gè)器官細(xì)胞譜系的調(diào)控程序仍不清楚,。近日,，中科院動(dòng)物研究所劉峰課題組與劍橋大學(xué)、加州大學(xué)圣地亞哥分校的研究人員在《Nature Cell Biology》雜志上合作發(fā)表了題為“Single-cell chromatin accessibility maps reveal regulatory programs driving early mouse organogenesis”的文章,，利用單細(xì)胞染色質(zhì)圖譜分析技術(shù),，對(duì)哺乳動(dòng)物器官發(fā)育的分子調(diào)控機(jī)制有了新的認(rèn)識(shí)。
E8.25小鼠胚胎的單核染色質(zhì)圖譜
對(duì)于小鼠而言,，8天左右的胚胎日齡是細(xì)胞類型多樣化的關(guān)鍵時(shí)期,，因?yàn)榇蠖鄶?shù)主要器官的前體細(xì)胞已經(jīng)形成。不過，由于早期胚胎中的細(xì)胞數(shù)量很有限,，也缺乏標(biāo)志物蛋白來區(qū)分各種細(xì)胞,，人們很難對(duì)其進(jìn)行分析。近期出現(xiàn)的單細(xì)胞分子圖譜繪制技術(shù),，終于讓人們有機(jī)會(huì)對(duì)早期器官發(fā)生時(shí)的細(xì)胞復(fù)雜性有了全面的認(rèn)識(shí),。
在這項(xiàng)研究中，研究人員首先利用單核ATAC-seq技術(shù),，繪制了來自10個(gè)小鼠胚胎（E8.25）的19,453個(gè)單細(xì)胞核的染色質(zhì)開放性圖譜（圖1a）,。他們合并所有數(shù)據(jù)并進(jìn)行peak calling，以此來定義開放的染色質(zhì)區(qū)域（OCR）,，并將峰的列表與已知的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）合并來鑒定稀有的細(xì)胞群,。
通過這種方式，他們生成了18個(gè)細(xì)胞群,，覆蓋三個(gè)胚層和胚胎外組織（圖1b）,。為了進(jìn)一步評(píng)估數(shù)據(jù)質(zhì)量，他們研究了α-珠蛋白基因簇,，該簇由胚胎（Hba-x）和成體（Hba-a1和Hba-a2）珠蛋白基因組成,，其上游增強(qiáng)子（R1–R4和Rm）的特征明確。他們發(fā)現(xiàn),，僅紅系細(xì)胞簇的增強(qiáng)子可開放（圖1c）,，也只有胚胎Hba-x基因處于開放染色質(zhì)中，與成體基因形成鮮明對(duì)比,。
圖1. 早期小鼠器官發(fā)生的單細(xì)胞染色質(zhì)圖譜
細(xì)胞特異性的染色質(zhì)圖譜
接下來,，研究人員定義了細(xì)胞類型特異性的染色質(zhì)，用于鑒定常見的生物學(xué)過程,。他們以19,453個(gè)細(xì)胞核作為變量,，利用其開放性差異來觀察305,187個(gè)基因組區(qū)域。圖譜顯示了細(xì)胞特異性的開放染色質(zhì)區(qū)域在不同部位的分離（圖2a）,。
同時(shí)他們還發(fā)現(xiàn),，相同胚層*的開放染色質(zhì)區(qū)域是相鄰的，而神經(jīng)中胚層前體細(xì)胞（NMP）的開放染色質(zhì)區(qū)域位于脊髓和體壁中胚層之間,，因此反映了發(fā)育譜系的關(guān)系,。細(xì)胞特異性的開放染色質(zhì)區(qū)域主要位于基因間和內(nèi)含子，而那些普遍存在的區(qū)域（在超過25%的細(xì)胞核中存在）則大多與啟動(dòng)子重合（圖2b）,。
圖2. 細(xì)胞特異性的染色質(zhì)圖譜
兩個(gè)TAL1結(jié)合的內(nèi)皮增強(qiáng)子
成長中的小鼠胚胎嚴(yán)重依賴于早期循環(huán)系統(tǒng)的建立,，以獲得充足的氧氣。血液和內(nèi)皮的發(fā)育通過共同的前體細(xì)胞,、標(biāo)記基因,、調(diào)控信號(hào)和蛋白密切關(guān)聯(lián),。在早期的小鼠胚胎中，一波的原始血細(xì)胞大概是在E7.5從中胚層前體中產(chǎn)生的,，瞬時(shí)表達(dá)與內(nèi)皮相關(guān)的基因,。隨后，在E8.25左右,，第二波得原始血細(xì)胞是從形成的內(nèi)皮細(xì)胞中產(chǎn)生。
為了評(píng)估一些內(nèi)皮細(xì)胞如何向血液轉(zhuǎn)化,，而其他內(nèi)皮細(xì)胞如何從尿囊中產(chǎn)生,，研究人員重新評(píng)估了標(biāo)注為尿囊、紅系和內(nèi)皮的開放性圖譜,。通過UMAP分析,，他們觀察到一系列內(nèi)皮細(xì)胞向血液轉(zhuǎn)化，表明它們具有造血性質(zhì),。同時(shí),，他們還檢測(cè)到一組可能從尿囊中轉(zhuǎn)化而來的內(nèi)皮細(xì)胞，與之前發(fā)表的文獻(xiàn)一致,。
鑒于轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子TAL1能破壞first and second blood waves,，研究人員接著探索了TAL1結(jié)合與染色質(zhì)開放性有何關(guān)聯(lián)。通過數(shù)據(jù)分析,，他們不僅鑒定出先前發(fā)現(xiàn)的內(nèi)皮增強(qiáng)子Erg+85 kb和Fli1−15 kb,，還發(fā)現(xiàn)了位于Flt1和Maml3基因的候選增強(qiáng)子（分別為Flt1+67 kb和Maml3+360 kb）（圖3）。轉(zhuǎn)基因小鼠胚胎實(shí)驗(yàn)表明,，E11.5小鼠脈管系統(tǒng)中的兩種候選增強(qiáng)子均具有活性,，這也顯示了細(xì)胞特異性的染色質(zhì)圖譜有助于鑒定組織特異性的調(diào)控區(qū)域。
圖3. Flt1+67 kb和Maml3+360 kb是兩個(gè)內(nèi)皮特異性的增強(qiáng)子
Fev參與了血管內(nèi)皮細(xì)胞的形成
正如前文所述,，尿囊細(xì)胞可以在E8.25轉(zhuǎn)化成內(nèi)皮細(xì)胞,。于是，研究人員便利用這種分化過程來研究胚胎發(fā)育過程中與內(nèi)皮細(xì)胞建立相關(guān)的調(diào)控程序,。他們發(fā)現(xiàn),，ETS轉(zhuǎn)錄因子Fev和Etv2聚集在一起，在每個(gè)軌跡的中間都有一個(gè)特定的表達(dá)峰,，表明它在胚胎內(nèi)皮的建立過程中發(fā)揮潛在作用,。
于是，他們?cè)诎唏R魚中開展了體內(nèi)研究,。他們將fev mRNA注入1-2個(gè)細(xì)胞階段的斑馬魚野生型胚胎中以評(píng)估fev過表達(dá)的作用,。他們發(fā)現(xiàn)，這導(dǎo)致斑馬魚10體節(jié)期（10s）的lmo2和tal1上調(diào)以及受精后26小時(shí)（26 hpf）的內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物flk1上調(diào),，而原始造血標(biāo)志物gata1a沒有上調(diào),，這支持了fev在賦予內(nèi)皮特性上的作用,。之后的一系列分析也表明，fev為血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)育初階段的調(diào)控因子,。