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大腸桿菌

TSS 葡萄糖 LB

離心機 分光光度計 搖床

1.  按1：100的比例將過夜培養(yǎng)的菌液如人到新鮮的LB培養(yǎng)液中,，于37℃培養(yǎng)至為OD₆₀₀為0.3~0.4,。

2.  加入等體積的2x SS于菌液中，在冰上溫和地混勻,。

3.  將100 ul 感受恣細菌和1~5 ul DNA加入到一個冰冷的聚丙烯管或玻璃管中,，4℃放置5~60 min。

4.  加入0.9 ml 含20 mmol/l 萄糖的LB培養(yǎng)液,，37℃溫和振蕩培養(yǎng)30~60 min 在合適的平扳上挑選轉化體,。

大腸桿菌

LB SOC

電轉化儀 離心機 分光光度計

1.  接種一個單菌落于5 ml LB培養(yǎng)液,，37℃溫和振搖培養(yǎng)5 h 或過夜。

2.   將2.5 ml 培養(yǎng)物加人到盛有500 ml LB培養(yǎng)液的2 L 燒瓶中,，37℃搖勻振蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀為0.5~0.6,。

3.  細菌在冰水浴冷卻10~15 min，然后轉移到預冷的1升離心瓶中,。于2℃,，5 000 g 離心20 min 沉淀用5 ml 預冷的水溶解6。

4.  加入500 ml 冰冷的水,，混勻,，按步驟3重復離心1次，立即將上清倒掉,，用殘余的液體重懸細胞,。

5.  新鮮制得的細菌

（1）將懸浮液加入到預冷的50 ml 聚丙烯管中，2℃,，5 000 g 離心10 min,。

（2）估計細胞沉淀的體積，沉淀用等體積的冰冷水重懸,。

（3）按50~300 ul 分裝于預冷的微量離心管中,。

6.  凍存細菌

（1）加入40 ml 冰冷的10%甘油，混合,，然后按照步驟5離心,。

（2）估計沉淀的體積，然后加入等體積的冰冷的10%甘油,，重懸菌體,。

（3）按50~300 ul 分裝于預冷的微量離心管中。

（4）于干冰上冷凍并貯存于-80℃。

7.  將電轉化儀調到2.5 kV,、 25 uF ,，脈沖控制器調到200~400Ω;。

8.  將1 ul 質粒DNA加入到盛有新鮮制備的細菌或融化的凍存細菌的小管中,，混勻,。

9.  將轉化混合物轉移到預冷的電轉化池中，吸干池的外表面,，然后放入樣品槽中,。
 

10.  進行脈沖電轉化，然后取出電轉化池,，馬上加入1 ml SOC培養(yǎng)液,，并且用巴斯德吸管轉移到無菌的培養(yǎng)管中。

11.  于37℃,，中速振蕩培養(yǎng)30~60 min,。

12.  分小份涂布于含有抗生素的LB平板上。