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熒光素 4-單氧酶（ATP-水解）提取于螢火蟲,，Photinus Pyralis,。

熒光素＋ATP＋O₂→氧和蟲熒光素＋PP_i＋H₂O＋光

光密度 I 是和 Michaelis-Menten 等式相關(guān)的

式中,，H 是 Planck 常量,；v 是發(fā)射光的頻率,。當(dāng) ATP 濃度非常低（［ATP］＜＜Km）時，Michaelis-Menten 等式就可以簡化成：

I＝常量 ×［ATP］

常量＝Ｖ/Km,。光密度與 [ATP] 成正比,。

熒光素酶

Tris-乙酸 ATP MgSO4 熒光素

分光光度計

實驗所需「試劑」具體見「其他」

開始加入 0.01 ml ATP

10 s 后（25℃）讀光密度值（562 nm 處的放射大值）,。利用在 0.05～0.5 umol/L 之間的 ATP 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

一個酶單位被定義為,，在 25℃ 甘氨酸-Tris pH 7.6 溶液中,，含 5 pmol ATP 及 7.5 nmol熒光素的 50 ul 實驗混合物所測量到的光輸出。一個光輸出單位產(chǎn)生一個生物計高峰相當(dāng)于在 PPO/POPOP 雞尾酒中 ¹⁴C 的 0.02 uCi（1991 年以前,，1 個單位是指 pH 7.7,、25℃ 時，存在 0.6 mmol/L ATP 和 0.1 mmol/L D-熒光素的條件下，每分鐘能產(chǎn)生 1 nmol 焦磷酸的熒光素的量）,。

試劑

0.1 mol/L Tris-乙酸,，pH 7.75

10 mol/L ATP（二鈉鹽，三水合物,，Mr＝605.2,；準(zhǔn)備 10 mmol/L 60.5 mg 溶于 10 ml 溶液并且稀釋 10 ul 于 10 ml 水中）

0.1 mol/L MgSO₄（MgSO₄·7H₂O，Mr＝246.5,；246 mg 溶于 10 ml 水中）

1 mol/L 熒光素（4,，5-二氫-［6-羥基-2-苯噻唑］-4-噻唑酸，Mr＝280.3,；鈉鹽,，Mr＝302.3；3 mg 溶于10 ml 0.1 mol/L Tris-乙酸 pH 7.75,， 儲存于 -20℃）,。

熒光素酶（提取于螢火蟲，1 ug/ml溶于 0.1 mol/L Tris-乙酸,，pH 7.75）