化工儀器網(wǎng)
技術(shù)文章
WB半定量?jī)?nèi)參有丟失,，你卻一直不知道,？
閱讀：659 發(fā)布時(shí)間：2020-9-1蛋白研究中,，要檢測(cè)一個(gè)基因的表達(dá)產(chǎn)物是否正確,，或者比較表達(dá)產(chǎn)物量的相對(duì)變化，選方法是Western Blot,，WB可對(duì)蛋白進(jìn)行定性和半定量分析,。我們天天都在做，但是半定量我們真的做對(duì)了嗎,？我們先來看看以下幾個(gè)概念,。
半定量
所謂的半定量，是將各樣品目的蛋白量分別除以其內(nèi)參含量,，得到的數(shù)值即為內(nèi)參校正后的各樣品中目的蛋白相對(duì)含量,，再用此數(shù)值進(jìn)行樣品間的比較和分析，得到目的蛋白含量在不同樣品間的實(shí)際變化結(jié)果,，是一個(gè)比值差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,。
內(nèi)部參照
內(nèi)參即是內(nèi)部參照（Internal Control），對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)來說一般是指由管家基因編碼表達(dá)的蛋白（Housekeeping Proteins）,，它們?cè)诟鹘M織和細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)恒定,，在檢測(cè)蛋白的表達(dá)水平變化時(shí)常用它來做參照物，借助檢測(cè)每個(gè)樣品內(nèi)參的量就可以用于校正上樣誤差,，這樣半定量的結(jié)果才更為可信,。
總蛋白提取
從培養(yǎng)的細(xì)胞/組織中提取全蛋白，也叫總蛋白,，是蛋白質(zhì)分析和純化常用的方法之一,。理想的蛋白提取案應(yīng)該能夠從樣品中提取所有蛋白質(zhì)而不產(chǎn)生偏差。
然而,，由于樣品之間,，蛋白質(zhì)間之間都具有很大的差異，使得總蛋白提取時(shí)同時(shí)釋放和溶解所有蛋白,，變得極為困難,。例如：蛋白質(zhì)與膜整合或與其他蛋白質(zhì)或核酸形成復(fù)合體時(shí)，都將大阻礙蛋白提取的效率,。因此,，與體內(nèi)情況相比，提取的蛋白質(zhì)可能或多或少的失真,。因此,，內(nèi)參的相對(duì)量也可能被改變,。
讀而思
duersi
我們使用RIPA裂解液提取蛋白后通常產(chǎn)生RIPA可溶性組分和RIPA不可溶性組分，RIPA不可溶組分通常會(huì)被丟棄掉,，扔掉的不可溶組分中有沒有內(nèi)參呢,？我們的目的蛋白又有哪些變化呢？我們解析了如下文獻(xiàn)：
1
Kevin A. Janes,，2017,，Sci Signal. ; 8(371): rs2. doi:10.1126/scisignal.2005966.
實(shí)驗(yàn)方法：
1.HT-29人結(jié)腸腺癌細(xì)胞使用RIPA裂解液裂解，RIPA不可溶組分使用Laemmli 樣品緩沖液煮沸上樣,。
2.WB檢測(cè)20種不同的抗體,。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
1. RIPA裂解液有效地溶解了許多細(xì)胞質(zhì)蛋白和信號(hào)蛋白，如 GAPDH,，Hsp90,，IκBα等。
2.但Actin,，tubulin,，Lamin A和KRT5等蛋白在RIPA不可溶組分中大量丟失。
3. 值得注意的是：RIPA不可溶性組分不僅限于細(xì)胞骨架蛋白,，轉(zhuǎn)錄因子GATA2和細(xì)胞粘附蛋白β-catenin也有丟失。
4.而和DNA緊密結(jié)合的蛋白質(zhì)H3則*存在于RIPA不可溶組分中,。
2
實(shí)驗(yàn)方法：
1.野生型和CBL三重缺陷型原代小鼠乳腺上皮細(xì)胞分別使用RIPA提取蛋白,，離心后的RIPA不可溶組分用SDS樣品buffer直接溶解上樣。
2.WB檢測(cè)EGFR,，HSP90,，c-Src，Tubuin,，pY-1068EGFR,，pY-416c-Src。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
1.Tubulin在RIPA不可溶組分中大量丟失,。
2.有些蛋白（pY-1068EGFR）不存在于RIPA不可溶組分中,，而有些蛋白（pY-416c-Src）則出現(xiàn)嚴(yán)重丟失，甚至不可溶性組分中信號(hào)比可溶性組分更強(qiáng),。
3.同一種蛋白（EGFR,，HSP90，c-Src）在不同樣品中丟失的情況并不相同,。
同樣的問題在SU YEON LEE和Eugene Khandros等人的研究中也出現(xiàn)了,，Tubulin和Actin等常用內(nèi)參在RIPA不可溶組分中大量丟失，如下圖：
SU YEON LEE,，2010,，
DOI: 10.3892/or_00000830
Eugene Khandros,，2012，DOI1 0.1182/blood-2011-12-397729
總結(jié)
使用RIPA提取的總蛋白
1.并非是真正意義上的總蛋白,，相當(dāng)一部分蛋白丟失在棄去的不可溶組分中,。
2.很多常用的內(nèi)參，如Actin,，tubulin,，LaminA，H3等均在RIPA不可溶組分中被丟失,。
3.目標(biāo)蛋白可能會(huì)在RIPA不可溶組分中被丟失,，也可能不被丟失，具有不可預(yù)見性,，非選擇性,。
4.同種蛋白在不同樣品中丟失的情況并不相同，蛋白丟失并不成比例,。
5.利用目的蛋白和內(nèi)參比值做校正會(huì)出現(xiàn)偏差,，不適合WB目的蛋白的半定量分析。
樣品制備時(shí)出現(xiàn)蛋白丟失的問題,，真的是我們這么多年一直忽視的問題,，特別是內(nèi)參會(huì)丟失，目的蛋白可能丟,，也可能不丟,，這樣的半定量結(jié)果是有偏差，不嚴(yán)謹(jǐn)?shù)?，所以要給與重視,！
Invent給大家如下解決方案：
獲取樣品中完整的蛋白質(zhì)圖譜，真實(shí)的反映所有蛋白質(zhì)種類和比例,。
獲取大的蛋白質(zhì)溶解度,，少的蛋白損失。
操作簡(jiǎn)單,，時(shí)間短,。
