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免疫組織化學(xué)
閱讀：413 發(fā)布時(shí)間：2020-8-28免疫組織化學(xué) IHC
免疫組織化學(xué)又稱免疫細(xì)胞化學(xué),，是指帶顯色劑標(biāo)記的特異性抗體在組織細(xì)胞原位通過抗原抗體反應(yīng)和組織化學(xué)的呈色反應(yīng)，對相應(yīng)抗原進(jìn)行定性,、定位,、定量測定的一項(xiàng)新技術(shù),。它把免疫反應(yīng)的特異性、組織化學(xué)的可見性巧妙地結(jié)合起來,，借助顯微鏡(包括熒光顯微鏡,、電子顯微鏡)的顯像和放大作用，在細(xì)胞,、亞細(xì)胞水平檢測各種抗原物質(zhì)(如蛋白質(zhì),、多肽、酶,、激素,、病原體以及受體等)。 免疫組化技術(shù)近年來得到迅速發(fā)展,。50年還僅限于免疫熒光技術(shù),，50年代以后逐漸發(fā)展建立起高度敏感，且更為實(shí)用的免疫酶技術(shù),。
免疫組織化學(xué)的全過程包括：1.抗原的提取與純化,；2.免疫動(dòng)物或細(xì)胞融合，制備特異性抗體以及抗體的純化,；3.將顯色劑與抗體結(jié)合形成標(biāo)記抗體,；4.標(biāo)本的制備；5.免疫細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)以及呈色反應(yīng),；6.觀察結(jié)果,。
免疫組化基礎(chǔ)知識(shí)
免疫組織化學(xué)的概念：
免疫組化是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理,，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑 (熒光素、酶,、金屬離子,、同位素) 顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原(多肽和蛋白質(zhì))，對其進(jìn)行定位,、定性及定量的研究,，稱為免疫組織化學(xué)。
免疫組化實(shí)驗(yàn)所用的抗體有哪些,？
免疫組化實(shí)驗(yàn)中常用的抗體為單克隆抗體和多克隆抗體,。單克隆抗體是一個(gè)B淋巴細(xì)胞克隆分泌的抗體，應(yīng)用細(xì)胞融合雜交瘤技術(shù)免疫動(dòng)物制備,。多克隆抗體是將純化后的抗原直接免疫動(dòng)物后,，從動(dòng)物血中所獲得的免疫血清，是多個(gè)B淋巴細(xì)胞克隆所產(chǎn)生的抗體混合物,。
免疫組化實(shí)驗(yàn)所用的組織和細(xì)胞標(biāo)本有哪些,？
實(shí)驗(yàn)所用主要為組織標(biāo)本和細(xì)胞標(biāo)本兩大類，前者包括石蠟切片（病理大片和組織芯片）和冰凍切片,，后者包括組織印片,、細(xì)胞爬片和細(xì)胞涂片。其中石蠟切片是制作組織標(biāo)本用,、基本的方法,，對于組織形態(tài)保存好，且能作連續(xù)切片,，有利于各種染色對照觀察,；還能長期存檔，供回顧性研究,；石蠟切片制作過程對組織內(nèi)抗原暴露有一定的影響,，但可進(jìn)行抗原修復(fù)，是免疫組化中選的組織標(biāo)本制作方法,。
石蠟切片為什么要做抗原修復(fù),？有哪些方法？
石蠟切片標(biāo)本均用甲醛固定,，使得細(xì)胞內(nèi)抗原形成醛鍵,、羧甲鍵而被封閉了部分抗原決定簇，同時(shí)蛋白之間發(fā)生交聯(lián)而使抗原決定簇隱蔽,。所以要求在進(jìn)行IHC染色時(shí),，需要先進(jìn)行抗原修復(fù)或暴露，即將固定時(shí)分子之間所形成的交聯(lián)破壞,，而恢復(fù)抗原的原有空間形態(tài),。
常用的抗原修復(fù)方法有微波修復(fù)法,，高壓加熱法，酶消化法,，水煮加熱法等,，常用的修復(fù)液是pH6.0的0.01 mol/L的檸檬酸鹽緩沖液。
免疫組化常用的染色方法有哪些,？
根據(jù)標(biāo)記物的不同分為免疫熒光法，免疫酶標(biāo)法,，親和組織化學(xué)法,，后者是以一種物質(zhì)對某種組織成分具有高度親合力為基礎(chǔ)的檢測方法。這種方法敏感性更高,，有利于微量抗原(抗體)在細(xì)胞或亞細(xì)胞水平的定位,，其中生物素——抗生物素染色法用。
抗體交叉反應(yīng)的原因：
指抗體除與其相應(yīng)的抗原發(fā)生特異性反應(yīng)外還與其它抗原發(fā)生反應(yīng),。產(chǎn)生的原因有以下幾個(gè)方面：
1. 抗原特異性指用于免疫動(dòng)物的抗原性物質(zhì)中含有多種抗原分子,，它引起動(dòng)物產(chǎn)生針對多種抗原分子特異性的相應(yīng)抗體。任何其它物質(zhì)只要含有一種或多種與上述物質(zhì)相同的抗原分子,，必將與上述多特異性的抗血清發(fā)生交叉反應(yīng),。
2. 共同決定簇即兩種抗原分子中都含有相同的抗原決定簇。
3. 決定簇相似,，兩種不同的抗原決定簇,，如果結(jié)構(gòu)大致相同，由于空間構(gòu)象關(guān)系,，某一決定簇的相應(yīng)抗體可以與大致相同的決定簇發(fā)生交叉反應(yīng),。當(dāng)然抗原一抗體之間構(gòu)象相似時(shí)的結(jié)合力小于吻合時(shí)的結(jié)合力。
多抗和單抗特性比較：
1.均一性,。一種單抗中,，每個(gè)抗體的化學(xué)結(jié)構(gòu)和氨基酸順序都相同，只有一種Ig亞類,。即單抗是一種純度很高的均一抗體,。而從不同動(dòng)物，不同時(shí)期所得到的多抗,，各有不同的化學(xué)組成,。多抗是多種種類和亞類Ig的混合物。
2. 穩(wěn)定性,。單抗的穩(wěn)定較差,，對PH變化敏感，對熱不穩(wěn)定,，提純過程中易變性,，而多抗的穩(wěn)定性則較好,。
3. 特異性。單抗是單一地針對抗原的某一決定簇,，所以用它進(jìn)行血清學(xué)反應(yīng)時(shí),，特異性強(qiáng)，敏感性高,，一般不發(fā)生交叉反應(yīng),。而多抗能與抗原上的多種抗原決定簇結(jié)合，所以特異性較差,，較易引起交叉反應(yīng),。
4.重復(fù)性。單抗的重復(fù)性好,，而多抗每批都不一樣,。
5. 沉淀反應(yīng)。多抗由于與抗原多價(jià)結(jié)合容易形成網(wǎng)絡(luò)樣沉淀,，而單抗只與抗原結(jié)合產(chǎn)生二聚體,，不能直接形成抗原抗體沉淀物。
抗體的保存：
抗體儲(chǔ)存容器應(yīng)由不吸附蛋白質(zhì)的材料制成,，常用的有聚丙烯,，聚碳酸酯和硼硅酸玻璃。如儲(chǔ)存的抗體中蛋白濃度很低（10-100mg/L）,，就應(yīng)另加隔離蛋白以減少容器對抗體蛋白的吸附,，隔離蛋白常用0.1%-1.0%的牛血清白蛋白。絕大多數(shù)已稀釋的抗體應(yīng)存在4℃-8℃條件下,，以免凍融對抗體蛋白產(chǎn)生有害效應(yīng),。抗體原液和已分離的免疫球蛋白組分應(yīng)保存于-20℃條件下,，并避免反復(fù)凍融,。冷凍的抗體溶液應(yīng)置于室溫中緩慢地解凍，應(yīng)避免用高溫快速解凍,。被細(xì)菌污染的抗體常會(huì)出現(xiàn)假陽性結(jié)果,，應(yīng)將污染的抗體溶液及其他試劑棄之。為防止細(xì)菌污染,，可于抗體溶液中加入0.01%疊氮鈉,。抗體經(jīng)真空冷凍干燥后置-20℃以下可保存3-5年,。保存稀釋后的單抗應(yīng)加入0.1%疊氮鈉濃度,。大多數(shù)稀釋抗體可進(jìn)行冷凍保存，少數(shù)抗體可能會(huì)丟失抗原活性。大多數(shù)單抗,，只要蛋白濃度適當(dāng),，可在4℃下保存數(shù)月。