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背景介紹：

TNF-α是一種單核因子，主要由單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生,。小鼠的 TNF-α基因長約 2.78kb,，由 4 個外顯子和 3 個內(nèi)含子組成,。小鼠 TNF-α前體含 235 個氨基酸殘基，信號肽 為 79 氨基酸殘基,。成熟的小鼠 TNF-α分子量為 17kDa,，由 156 個氨基酸殘基組成。鼠與人 的 TNF-a 有 79％氨基酸有同源性,，TNF-α的生物學(xué)作用無明顯的種屬特異性,。TNF-α的生 物學(xué)活性非常復(fù)雜，包括對造血,、免疫和炎癥的調(diào)節(jié),，對血管和凝血的影響及多種器官（肝、 心臟,、骨,、軟骨、肌肉和其它組織）的作用

檢測原理：

小鼠腫瘤壞死因子-a ELISA 試劑盒采用基于雙抗體夾心法的酶聯(lián)免疫吸附檢測技術(shù),。將 抗小鼠 TNF-a 單克隆抗體包被在酶標(biāo)板上,；分別加入梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品和預(yù)稀釋的樣本， 標(biāo)準(zhǔn)品和樣本中的小鼠 TNF-a 會與酶標(biāo)板上的包被抗體充分結(jié)合,；洗板后加入生物素化抗 小鼠 TNF-a 抗體,，該抗體會與板子上包被抗體捕獲的標(biāo)準(zhǔn)品和樣本中的小鼠 TNF-a 發(fā)生特 異性結(jié)合,；洗板后加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的鏈霉親和素，生物素與鏈霉親和素會 發(fā)生高強(qiáng)度的非共價結(jié)合,；洗板后加入顯色劑底物 TMB,，若反應(yīng)孔中樣品存在不同濃度的 小鼠 TNF-a，則 HRP 會使無色 TMB 變成不同深淺（正相關(guān)）的藍(lán)色物質(zhì),，加入終止液后反 應(yīng)孔會變成黃色,；后，在λmax=450 nm（OD=450 nm）處測定反應(yīng)孔樣品吸光度（OD）,， 樣本中的小鼠 TNF-a 濃度與 OD 成正比,，通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線和四參數(shù)擬合軟件便可計算出 樣本中小鼠 TNF-a 的濃度。

原理圖：

注意事項：※※※

1. 試劑盒應(yīng)在有效期內(nèi)使用,，請不要使用過期的試劑,。

2. 試劑盒未使用時應(yīng)保存在 2-8℃冰箱，已復(fù)溶但未用完的標(biāo)準(zhǔn)品,，請丟棄,。

3. 試劑盒使用前請在室溫恢復(fù) 30 min，且充分混勻試劑盒里的各種成份及制備的樣品,。

4. 在試驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)品和樣本建議作復(fù)孔檢測,，且加入試劑的順序應(yīng)保持一致。

5. 為避免交叉污染,，請在試驗(yàn)中使用 1 次性試管,，槍頭，封板膜（※）及潔凈塑料容器,。.

6. 濃縮生物素化抗體和濃縮酶結(jié)合物的體積較少,，在運(yùn)輸過程中微量液體會沾到管壁及瓶 蓋上，使用前請離心處理（5-10 S 即可）,，使管壁上的液體集中在管底部,，取用時，請 用移液器小心吹打幾次,。

7. 除了試劑盒中的濃縮洗滌液和終止液可以通用外,，請不要使用其他來源試劑盒內(nèi)含的 試劑代替本試劑盒中的某單個組分。

8. 為保證結(jié)果準(zhǔn)確,，每次檢測均需做標(biāo)準(zhǔn)曲線,。

安全提示：試劑盒中的終止液為酸性溶液，操作人員在使用時請帶上手套并注意防護(hù),；在操 作過程中也要避免試劑接觸皮膚和眼睛,，如果不慎接觸，請用大量清水清洗,；檢測血液樣本 及其它體液樣本時,，請按國家生物實(shí)驗(yàn)室安全防護(hù)有關(guān)管理規(guī)定執(zhí)行,。

試劑盒組成及儲存： 

 

自備實(shí)驗(yàn)器材（不提供，可代購）

1． 酶標(biāo)儀（主波長 450nm,，參考波長 630nm）

2． 高精度移液器及一次性吸頭：0.5-10,2-20,20-200,200-1000μl

3． 洗板機(jī)或洗瓶

4． 37℃孵育箱

5． 雙蒸水,，去離子水，量筒等

6． 稀釋用聚丙烯試管

樣本收集及儲存： 1. 細(xì)胞培養(yǎng)上清： 將細(xì)胞培養(yǎng)基移至無菌離心管,，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min,然后將上清等量分裝 于小 EP 管并于-20℃下保存（24 小時內(nèi)檢測可放入 2-8℃儲存）,，避免反復(fù)凍融。

2. 血清樣本： 室溫血液自然凝固 20 min 后,，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min,，然后將上清等量分裝 于小 EP 管并于-20℃下保存（24 小時內(nèi)檢測可放入 2-8℃儲存），保存過程中如有沉淀,， 請再次離心，避免反復(fù)凍融,。

3. 血漿樣本： 將全血收集到含抗血凝劑的管中,，根據(jù)標(biāo)本的實(shí)際要求選擇 EDTA，檸檬酸鈉或肝素作 為抗凝劑,，混合 20 min,，在 4℃條件下 1000×g 離心 10 min，然后將上清等量分裝于小 EP 管并于-20℃下保存（24 小時內(nèi)檢測可放入 2-8℃儲存）,，避免反復(fù)凍融,。

※注意：血清血漿樣本避免使用溶血、高血脂樣本,，以免影響檢測結(jié)果,；如果樣本中的靶標(biāo) 物檢測濃度高于標(biāo)準(zhǔn)品的高值，請將樣品做適當(dāng)倍數(shù)稀釋后檢測,，建議正式實(shí)驗(yàn)前做預(yù)實(shí) 驗(yàn)以確定稀釋倍數(shù),。

試劑準(zhǔn)備：

1. 試劑回溫：首先在實(shí)驗(yàn)前 30 min 將試劑盒，待測樣本放置于室溫下,，濃縮洗滌液如出現(xiàn) 結(jié)晶,，請放入 37℃溫浴直到結(jié)晶全部溶解。

2. 配制洗滌液：預(yù)先計算好稀釋后的洗滌液使用體積,，然后用雙蒸水或去離子水將 20 倍 濃縮洗滌液稀釋成 1 倍應(yīng)用液,，未用完的濃縮洗滌液放入 4℃冰箱保存。

3. 標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋：加入標(biāo)準(zhǔn)品/樣本稀釋液（SR1）1ml至凍干標(biāo)準(zhǔn)品中,，靜置15分鐘待 其*溶解后輕輕混勻(濃度為2000pg/ml),，然后按照以下濃度：2000、1000,、 500,、 250,、 125、62.5,、31.25,、 0 pg/ml進(jìn)行稀釋。復(fù)溶過的標(biāo)準(zhǔn)品原液（2000pg/ml）未用完的應(yīng) 廢棄或根據(jù)需要按照一次用量分裝,，并將其貯存在-20～-80℃冰箱,，具體如下圖。

4. 生物素化抗體工作液：預(yù)先計算好試驗(yàn)所需用量,，用檢測稀釋液（SR2）將100倍抗體濃 縮液稀釋成1倍應(yīng)用工作液（稀釋前充分混勻）,，請在30分鐘內(nèi)加入到反應(yīng)孔中。 生物素化抗體工作液具體稀釋方法如下

5. 酶結(jié)合物工作液：按每次試驗(yàn)所需用量配制,，用酶結(jié)合物稀釋液（SR3）將40倍濃縮酶 結(jié)合物稀釋成1倍應(yīng)用工作液（稀釋前離心）,，請在30分鐘內(nèi)使用。

酶結(jié)合物工作液具體稀釋方法如下：

6. 洗滌方法： ? 自動洗板：甩盡酶標(biāo)板孔中液體,，在厚迭吸水紙上拍干,，注入洗滌液為 300ul/ 孔,注與吸出間隔為 30 秒，洗板 5 次,。 ? 手工洗板：甩盡酶標(biāo)板孔中液體,，在厚迭吸水紙上拍干，用洗瓶加入洗滌液 300ul/孔,，靜止 30 秒后甩凈酶標(biāo)板孔中液體,，在厚迭的吸水紙上拍干，洗板 5 次,。

檢測步驟：

結(jié)果判斷： 1.用酶標(biāo)儀 450 nm 波長測定 OD 值,。選擇雙波長檢測，參考波長為 630 nm,。如不能進(jìn)行 雙波長檢測,，請用 450 nm 的 OD 測定值減去 630 nm 的 OD 測定值。 2.計算標(biāo)準(zhǔn)品,、樣品的平均 OD 值：每個標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)本的 OD 值應(yīng)減去零孔的 OD 值 3.以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo),，吸光度OD值為縱坐標(biāo)，用軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,，樣品中TNF-a含量 可通過對應(yīng)OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的濃度,。 4.若標(biāo)本 OD 值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)做適當(dāng)稀釋后重新檢測,，計算濃度時再乘以稀釋倍數(shù),。

參數(shù)表征： 1. 數(shù)據(jù)及標(biāo)準(zhǔn)曲線

 

本圖僅供參考，應(yīng)以當(dāng)次試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算小鼠 TNF-a 的樣本含量 2. 靈敏度： 低可檢測小鼠 TNF-a 濃度達(dá) 15pg/ml,， 20 個零標(biāo)準(zhǔn)品濃度 OD 的平均值加上兩個標(biāo)準(zhǔn)差,，計算相應(yīng)的可檢測濃度,。 3. 特異性： 不與小鼠G-CSF 、GM-CSF,、IL-1α,、IL-1β、IL-2,、3,、5、6,、7,、9等反應(yīng)，人的TNF-α,、TNF sRI,、 TNF sRII等反應(yīng) 4. 重復(fù)性： 板內(nèi)，板間變異系數(shù)<10% 5. 回收率： 在選取的健康小鼠血漿,、細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入 3 個不同濃度水平的小鼠 TNF-a,，計算回收 率。

6. 線性稀釋： 分別在選取的 4 份健康小鼠血漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入高濃度小鼠 TNF-a,，在標(biāo)準(zhǔn)曲線動 力學(xué)范圍內(nèi)進(jìn)行稀釋，評估線性,。