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PCR污染與對(duì)策匯總
閱讀：373 發(fā)布時(shí)間：2020-1-6PCR反應(yīng)的大特點(diǎn)是具有較大擴(kuò)增能力與*的靈敏性,，但令人頭痛的問(wèn)題是易污染,，極其微量的污染即可造成假陽(yáng)性的產(chǎn)生.
污染原因
(一)標(biāo)本間交叉污染:標(biāo)本污染主要有收集標(biāo)本的容器被污染，或標(biāo)本放置時(shí),，由于密封不嚴(yán)溢于容器外,，或容器外粘有標(biāo)本而造成相互間交叉污染;標(biāo)本核酸模板在提取過(guò)程中，由于吸樣槍污染導(dǎo)致標(biāo)本間污染;有些微生物標(biāo)本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴(kuò)散,，導(dǎo)致彼此間的污染.
(二)PCR試劑的污染:主要是由于在PCR試劑配制過(guò)程中,，由于加樣槍、容器,、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染.
(三)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染.這是PCR反應(yīng)中主要見(jiàn)的污染問(wèn)題.因?yàn)镻CR產(chǎn)物拷貝量大(一般為1013拷貝/ml),，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PCR檢測(cè)數(shù)個(gè)拷貝的極限，所以極微量的PCR產(chǎn)物污染,，就可造成假陽(yáng)就可形成假陽(yáng)性.
還有一種容易忽視,，可能造成PCR產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠污染；在空氣與液體面摩擦?xí)r就可形成氣溶膠,，在操作時(shí)比較劇烈地?fù)u動(dòng)反應(yīng)管,，開(kāi)蓋時(shí)、吸樣時(shí)及污染進(jìn)樣槍的反復(fù)吸樣都可形成氣溶膠而污染.據(jù)計(jì)算一個(gè)氣溶膠顆?？珊?8000拷貝,，因而由其造成的污染是一個(gè)值得特別重視的問(wèn)題.
(四)實(shí)驗(yàn)室中克隆質(zhì)粒的污染:在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室及某些用克隆質(zhì)粒做陽(yáng)性對(duì)照的檢驗(yàn)室，這個(gè)問(wèn)題也比較常見(jiàn).因?yàn)榭寺≠|(zhì)粒在單位容積內(nèi)含量相當(dāng)高,，另外在純化過(guò)程中需用較多的用具及試劑,，而且在活細(xì)胞內(nèi)的質(zhì)粒，由于活細(xì)胞的生長(zhǎng)繁殖的簡(jiǎn)便性及具有很強(qiáng)的生命力.其污染可能性也很大.
污染的監(jiān)測(cè)
一個(gè)好的實(shí)驗(yàn)室,，要時(shí)刻注意污染的監(jiān)測(cè),，考慮有無(wú)污染是什么原因造成的污染，以 便采取措施,，防止和消除污染.
對(duì)照試驗(yàn)
1.陽(yáng)性對(duì)照:在建立PCR反應(yīng)實(shí)驗(yàn)室及一般的檢驗(yàn)單位都應(yīng)設(shè)有PCR陽(yáng)性對(duì)照,，它是PCR 反應(yīng)是否成功、產(chǎn)物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個(gè)重要的參考標(biāo)志.陽(yáng)性 對(duì)照要選擇擴(kuò)增度中等,、重復(fù)性好,，經(jīng)各種鑒定是該產(chǎn)物的標(biāo)本，如以重組質(zhì)粒為陽(yáng) 性對(duì)照,，其含量宜低不宜高(100個(gè)拷貝以下).但陽(yáng)性對(duì)照尤其是重組質(zhì)粒及高濃度陽(yáng) 性標(biāo)本,，其對(duì)檢測(cè)或擴(kuò)增樣品污染的可能性很大.因而當(dāng)某一PCR試劑經(jīng)自己使用穩(wěn) 定,，檢驗(yàn)人員心中有數(shù)時(shí)，在以后的實(shí)驗(yàn)中可免設(shè)陽(yáng)性對(duì)照.
2.陰性對(duì)照:每次PCR實(shí)驗(yàn)務(wù)必做陰性對(duì)照.它包括①標(biāo)本對(duì)照:被檢的標(biāo)本是血清就用 鑒定后的正常血清作對(duì)照;被檢的標(biāo)本是組織細(xì)胞就用相應(yīng)的組織細(xì)胞作對(duì)照.②試劑 對(duì)照:在PCR試劑中不加模板DNA或RNA,，進(jìn)行PCR擴(kuò)增,，以監(jiān)測(cè)試劑是否污染.
3.重復(fù)性試驗(yàn)
4.選擇不同區(qū)域的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增
防止污染的方法
一． 污染的預(yù)防
進(jìn)行PCR操作時(shí)，操作人員應(yīng)該嚴(yán)格遵守一些操作規(guī)程,，地降低可能出現(xiàn)的PCR污染或杜絕污染的出現(xiàn),。
（一）劃分操作區(qū)：目前，普通PCR尚不能做到單人單管,，實(shí)現(xiàn)*閉管操作,，但無(wú)論是否能夠達(dá)到單人單管，均要求實(shí)驗(yàn)操作在三個(gè)不同的區(qū)域內(nèi)進(jìn)行,，PCR的前處理和后處理要在不同的隔離區(qū)內(nèi)進(jìn)行：
1. 標(biāo)本處理區(qū),，包括擴(kuò)增摸板的制備；
2. PCR擴(kuò)增區(qū),，包括反應(yīng)液的配制和PCR擴(kuò)增,；
3. 產(chǎn)物分析區(qū)，凝膠電泳分析,，產(chǎn)物拍照及重組克隆的制備,。
各工作區(qū)要有一定的隔離，操作器材,，要有一定的方向性,。如：標(biāo)本制備→PCR擴(kuò)增→產(chǎn)物分析→產(chǎn)物處理。
切記：產(chǎn)物分析區(qū)的產(chǎn)物及器材不要拿到其他兩個(gè)工作區(qū),。
（二）分裝試劑：PCR擴(kuò)增所需要的試劑均應(yīng)在裝有紫外燈的超凈工作臺(tái)或負(fù)壓工作臺(tái)配制和分裝,。所有的加樣器和吸頭需固定放于其中，不能用來(lái)吸取擴(kuò)增后的DNA和其他來(lái)源的DNA：
1． PCR用水應(yīng)為高壓的雙蒸水,；
2． 引物和dNTP用高壓的雙蒸水在無(wú)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物區(qū)配制,；
3． 引物和dNTP應(yīng)分裝儲(chǔ)存，分裝時(shí)應(yīng)標(biāo)明時(shí)間,，以備發(fā)生污染時(shí)查找原因,。
(三) 實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng) 盡管擴(kuò)增序列的殘留污染大部分是假陽(yáng)性反應(yīng)的原因，樣品間的交叉污染也是原因之一,。因此,，不僅要在進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)是謹(jǐn)慎認(rèn)真，在樣品的收集,、抽提和擴(kuò)增的所有環(huán)節(jié)都應(yīng)該注意：
1. 戴一次性手套，若不小心濺上反應(yīng)液,，立即更換手套,；
2. 使用一次性吸頭,，嚴(yán)禁與PCR產(chǎn)物分析室的吸頭混用，吸頭不要長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣中,，避免氣溶膠的污染,；
3. 避免反應(yīng)液飛濺，打開(kāi)反應(yīng)管時(shí)為避免此種情況,，開(kāi)蓋前稍離心收集液體于管底,。若不小心濺到手套或桌面上，應(yīng)立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面,；
4. 操作多份樣品時(shí),，制備反應(yīng)混合液，先將dNTP,、緩沖液,、引物和酶混合好，然后分裝,，這樣即可以減少操作,，避免污染，又可以增加反應(yīng)的精確度,；
5. 后加入反應(yīng)模板,，加入后蓋緊反應(yīng)管；
6. 操作時(shí)設(shè)立陰陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照,，即可驗(yàn)證PCR反應(yīng)的可靠性,，又可以協(xié)助判斷擴(kuò)增系統(tǒng)的可信性；
7. 盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器,，由于加樣器容易受產(chǎn)物氣溶膠或標(biāo)本DNA的污染,，使用可替換或高壓處理的加樣器。如沒(méi)有這種特殊的加樣器,，至少PCR操作過(guò)程中加樣器應(yīng)該,，不能交叉使用，尤其是PCR產(chǎn)物分析所用加樣器不能拿到其它兩個(gè)區(qū),；
8. 重復(fù)實(shí)驗(yàn),，驗(yàn)證結(jié)果，慎下結(jié)論,。
二． 追蹤污染源
如果不慎發(fā)生污染情況,，應(yīng)從下面幾條出發(fā)，逐一分析,，排除污染,。
（一）設(shè)立陰陽(yáng)性對(duì)照：有利于監(jiān)測(cè)反應(yīng)體系各成分的污染情況。選擇陽(yáng)性對(duì)照時(shí),，應(yīng)選擇擴(kuò)增弱,，且重復(fù)性好的樣品,，因強(qiáng)陽(yáng)性對(duì)照可產(chǎn)生大量不必要的擴(kuò)增序列，反而可能成為潛在的污染源,。如果以含靶序列的重組質(zhì)粒為對(duì)照,，100個(gè)拷貝之內(nèi)的靶序列就足以產(chǎn)生陽(yáng)性擴(kuò)增。陰性對(duì)照的選擇亦要慎重,，因?yàn)镻CR敏感性*,，可以從其它方法（Sourthern 印跡或點(diǎn)雜交等）檢測(cè)陰性的標(biāo)本中檢測(cè)出極微量的靶分子。此外,，每次擴(kuò)增均應(yīng)包括PCR體系中各試劑的時(shí)機(jī)對(duì)照,，即包括PCR反應(yīng)所需的全部成分，而不加模板DNA,，這對(duì)監(jiān)測(cè)試劑中PCR產(chǎn)物殘留污染是非常有益的,。如果擴(kuò)增結(jié)果中試劑對(duì)照為陽(yáng)性結(jié)果，就是某一種或數(shù)種試劑被污染了,。此時(shí),，要全部更換一批新的試劑進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增時(shí)設(shè)立不同的反應(yīng)管,，每一管含有一種被檢測(cè)試劑,，在檢出污染試劑后，應(yīng)馬上處理,。
（二）環(huán)境污染：在排除試劑污染的可能性外,，更換試劑后，若不久又發(fā)現(xiàn)試劑被污染了,，如果預(yù)防措施比較嚴(yán)密,，則考慮可能為環(huán)境污染。
環(huán)境污染中常見(jiàn)的污染源主要有：
1. 模板提取時(shí)真空抽干裝置,；
2. 凝膠電泳加樣器,；
3. 電泳裝置；
4. 紫外分析儀,；
5. 切膠用刀或手術(shù)刀片,；
6. 離心機(jī)；
7. 冰箱門(mén)把手,，冷凍架,，門(mén)把手或?qū)嶒?yàn)臺(tái)面等；
此時(shí)可用擦拭實(shí)驗(yàn)來(lái)查找可疑污染源,。1）用無(wú)菌水浸泡過(guò)的滅菌棉簽擦拭可疑污染源,；2）0.1ml去離子水浸泡；3）取5ml做PCR實(shí)驗(yàn)；4）電泳檢測(cè)結(jié)果,。
8. 氣溶膠,。如果經(jīng)過(guò)上述追蹤實(shí)驗(yàn),，仍不能查找到確切污染源,，則污染可能是由空氣中PCR產(chǎn)物的氣溶膠造成的，此時(shí)就應(yīng)該更換實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所,，若條件不允許,，則重新設(shè)計(jì)新的引物（與原引物無(wú)相關(guān)性）。
三．污染處理
（一）環(huán)境污染
1. 稀酸處理法：對(duì)可疑器具用1mol/L鹽酸擦拭或浸泡,，使殘余DNA脫嘌呤,；
2. 紫外照射（UV）法：紫外波長(zhǎng)（nm）一般選擇254/300nm，照射30min即可,。需要注意的是,，選擇UV作為消除殘留PCR產(chǎn)物污染時(shí)，要考慮PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度與產(chǎn)物序列中堿基的分布,，UV照射僅對(duì)500bp以上長(zhǎng)片段有效,，對(duì)短片段效果不大。UV照射時(shí),，PCR產(chǎn)物中嘧啶堿基會(huì)形成二聚體,，這些二聚體可使延伸終止，但并不是DNA鏈中所有嘧啶均能形成二聚體,，且UV照射還可使二聚體斷裂,。形成二聚體的程度取決于UV波長(zhǎng)，嘧啶二聚體的類(lèi)型及與二聚體位點(diǎn)相鄰核苷酸的序列,。在受照射的長(zhǎng)DNA鏈上,，形成二聚體缺陷的數(shù)量少于0.065/堿基，其他非二聚體的光照損傷（如環(huán)丁烷型嘧啶復(fù)合體,，胸腺嘧啶乙二醇,，DNA鏈間與鏈內(nèi)的交聯(lián)和DNA斷裂等）均可終止Taq DNA聚合酶的延伸。這些位點(diǎn)的數(shù)量與二聚體位點(diǎn)相當(dāng),。如果這些位點(diǎn)（0.13/堿基）在DNA分子上隨機(jī)分布,，一個(gè)500bp片段的DNA分子鏈上將有32處損傷位點(diǎn)，那么,，105個(gè)這樣的分子中每個(gè)分子中會(huì)至少有一處損傷,。相反，如果100bp的片段,，每條鏈上僅有6處損傷,，105個(gè)拷貝分子中將有許多分子沒(méi)有任何損傷。這就是UV照射有一定的片段長(zhǎng)度限制的原因。
（二）反應(yīng)液污染
可采用下列方法之一處理：
1. DNase I法：PCR混合液（未加模板和Taq聚合酶）加入0.5U DNase I,，室溫反應(yīng)30 min后加熱滅活,，然后加入模板和Taq聚合酶進(jìn)行正常PCR擴(kuò)增。該方法的優(yōu)點(diǎn)是不需要知道污染DNA的序列,；
2. 內(nèi)切酶法：選擇識(shí)別4個(gè)堿基的內(nèi)切酶（如Msp I和Taq I等）,，可同時(shí)選擇幾種，以克服用一種酶只能識(shí)別特定序列的缺陷,，室溫作用1h 后加熱滅活進(jìn)行PCR,；
3. 紫外照射法：未加模板和Taq聚合酶的PCR混合液進(jìn)行紫外照射，注意事項(xiàng)與方法同上述UV照射法,；
4. g射線輻射法：1.5kGy的輻射可*破壞0.1ng基因組DNA,，2.0 kGy可破壞104拷貝的質(zhì)粒分子，4.0 kGy仍不影響PCR,，但高于此限度會(huì)使PCR擴(kuò)增效率下降,。引物可受照射而不影響PCR，g射線是通過(guò)水的離子化產(chǎn)生自由基來(lái)破壞DNA的,。
（三）尿嘧啶糖苷酶（UNG）法
由于UV照射的去污染作用對(duì)500bp以下的片段效果不好,，而臨床用于檢測(cè)的PCR擴(kuò)增片段通常為300bp左右，因此UNG的預(yù)防作用日益受到重視和肯定,。
1. 原理：在PCR產(chǎn)物或引物中用dU 代替dT,。這種dU化的PCR產(chǎn)物與UNG一起孵育，因UDG可裂解尿嘧啶堿基和糖磷酸骨架間的N-糖基鍵,，可除去dU而阻止TaqDNA聚合酶的延伸,，從而失去被再擴(kuò)增的能力。UNG對(duì)不含dU的模板無(wú)任何影響,。UNG可從單或雙鏈DNA中消除尿嘧啶,，而對(duì)RNA中的尿嘧啶和單一尿嘧啶分子則無(wú)任何作用。
2. dUTP法：用dUTP代替dTTP,，使產(chǎn)物中摻入大量dU,。在再次進(jìn)行PCR擴(kuò)增前，用UNG處理PCR混合液即可消除PCR產(chǎn)物的殘留污染,。由于UNG在PCR循環(huán)中的變性一步便可被滅活,，因此不會(huì)影響含dU的新的PCR產(chǎn)物。
3. dU引物法：合成引物時(shí)以dU 代dT,，這樣PCR產(chǎn)物中僅5ˊ端帶dU,。UNG處理后，引物失去了結(jié)合位點(diǎn)而不能擴(kuò)增,。對(duì)長(zhǎng)片段（1-2kb以上）的擴(kuò)增用dUTP法效率較用dTTP低,，而用dU法就可克服這一缺點(diǎn),。dU引物將dU設(shè)計(jì)在3ˊ端或近ˊ端。該法僅能用于引物以外試劑的處理,。
4. 優(yōu)點(diǎn)：可以去除任何來(lái)源的污染,；UNG處理可以和PCR擴(kuò)增在同一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)進(jìn)行；由于擴(kuò)增產(chǎn)物中有大量dU存在,，可*消除污染源,。
5. 需注意的是摻入dUTP的DNA不應(yīng)對(duì)產(chǎn)物的任何操作有影響，在進(jìn)行PCR產(chǎn)物克隆時(shí),，應(yīng)該轉(zhuǎn)化UNG-（UNG缺陷）大腸桿菌受體菌,，否則轉(zhuǎn)化產(chǎn)物會(huì)被受體菌UNG消化掉,。
（四） 固相捕獲法
用于去除標(biāo)本中污染的核酸和雜質(zhì),，原理如下：1）用一生物素標(biāo)記的單鏈RNA探針與待擴(kuò)核酸雜交，雜交區(qū)域是非擴(kuò)增區(qū),；2）用包被鏈霉親和素的固相載體來(lái)捕獲帶有生物素探針的雜交核酸,，通過(guò)漂洗可去除污染的擴(kuò)增產(chǎn)物和雜質(zhì)；3）洗脫靶分子后用特異引物擴(kuò)增非RNA探針雜交區(qū)域,。第2）步的漂洗后可用PCR檢測(cè)以確定標(biāo)本是否被擴(kuò)增產(chǎn)物或重組質(zhì)粒污染,。
（五）RS-PCR法（RNA-specific PCR）
也稱為鏈特異性PCR，主要指用于RNA模板的特異性PCR法,，該法可明顯降低假陽(yáng)性而不影響PCR的敏感性,。其關(guān)鍵在于設(shè)計(jì)引物，逆轉(zhuǎn)錄引物的3ˊ端（A區(qū)）有2 0個(gè)核苷酸左右為模板的特異性互不序列,，5ˊ端2 0個(gè)核苷酸（C區(qū)）為附加修飾堿基,。與mRNA逆轉(zhuǎn)錄后，經(jīng)超速離心使 cDNA與多余引物分開(kāi),，再用和第二引物（C）以鏈cDNA為模板合成第二鏈cDNA,，以后的PCR循環(huán)中用逆轉(zhuǎn)錄引物的B區(qū)和引物C進(jìn)行擴(kuò)增加尾cDNA，而污染的DNA或質(zhì)粒DNA才不會(huì)被擴(kuò)增,。
（六）抗污染引物法
該對(duì)引物擴(kuò)增時(shí)通過(guò)病毒DNA克隆如入質(zhì)粒的位點(diǎn),。這一區(qū)域只存在完整的原病毒中，在重組質(zhì)粒中,，這一區(qū)域分成兩個(gè)區(qū)域與克隆位點(diǎn)被,。如果重組質(zhì)粒污染了標(biāo)本，也不能擴(kuò)增出任何條帶,，即使出現(xiàn)了擴(kuò)增帶,，其大小也與預(yù)期的不同。只有原病毒DNA才能被引物擴(kuò)增,，因此只要出現(xiàn)預(yù)期大小的擴(kuò)增帶就可以證明標(biāo)本是陽(yáng)性的，該法試用于環(huán)狀靶分子系列。