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IHC培訓第1周
閱讀：360 發(fā)布時間：2020-1-6去年9月份的時候，小編推薦了Abcam的WB新手入門課程（每周一節(jié),，共分4節(jié)）,，不知道小伙伴們有沒有get到WB的全套技能呢？現(xiàn)在,，Abcam推出了實驗*的升級技能---IHC,，同樣是以每周一次課程的形式。跟著小編學起來吧,！
在第 1周的 IHC 培訓中，我們將展示如何開啟一個良好的開端,。如何制備樣本將會成為決定終數(shù)據質量的重要影響因素,。本次培訓中，我們將指導您完成 IHC 樣本處理的主要步驟,。
1,、什么是免疫組化?
免疫組化（immunohistochemistry，IHC）是利用抗原-抗體相互作用顯示組織切片中抗原分布和定位的一種方法,。
IHC 常用于診斷癌癥等疾病中的異常細胞和組織,。總體而言,，IHC 提供了有價值的觀點和支持,，使其他方法獲得的數(shù)據更加有據可依。
IHC 染色依賴于識別靶蛋白的抗體,，可以通過兩種檢測方法對抗原-抗體的相互作用進行可視化,，一種是顯色方法（酶偶聯(lián)抗體催化底物顯色，產生有色沉淀）,；另一種是熒光檢測法（熒光基團偶聯(lián)抗體產生熒光）,。
2、標本形式
IHC組織保存的兩種主要方法是石蠟包埋和組織冰凍（總結如下）：
| IHC-石蠟包埋 | IHC-組織冰凍 | |
| 切片厚度 | 4-5 µm | 4-10 µm |
| 固定 | 10%中性福爾馬林緩沖液 (neutral-buffered formalin, NBF) 預包埋 | 切片前或切片后,，多聚甲醛,、丙酮或丙酮: 乙醇 1:1 溶液 |
| 切片 | 切片機 | 冰凍機 |
| 儲存 | 室溫下儲存數(shù)年（抗原可能隨時間變化） | -80℃ 下儲存 1 年（-190℃ 下保存時間更長） |
| 優(yōu)點 | - 形態(tài)結構保存與抗原性的平衡； - 非常穩(wěn)定且易于使用,； | - 抗原處于更“天然”的狀態(tài),； - 適用于不耐受標準醛固定和石蠟處理的抗原； - 適用于磷酸化抗原表位,； |
| 缺點 | - 過度固定（超過 24 小時）可掩蓋抗原表位,； - 免疫染色前需要脫蠟； - 使用交聯(lián) [醛] 試劑固定需要進行抗原修復,； | - 如果形成冰晶,，形態(tài)保存可能比石蠟切片差； - 切片過厚會導致圖像分辨率較低，圖片拍攝效果較差,； - 樣本易碎,； |
3、固定
固定可防止離體組織自溶和壞死,，保留抗原特性,，提高組織成分的折射率，同時有助于保護樣本處理過程中的細胞成分,。靶抗原和所需的檢測技術都會影響固定劑的選擇,，如下圖所示。
圖 1：固定劑對免疫染色效果的影響,。和甲醛固定（左）相比,，用甲醇固定的 HeLa 細胞（右）中更易檢出組蛋白 H2B K5 巴豆酰化免疫組化結果,。一抗：ab177139,，組蛋白 H2B（K5巴豆酰化）的兔多克隆抗體,，1 μg/mL,。二抗：ab150081，山羊抗兔 IgG H&L (Alexa Fluor® 488),，0.5 μg/mL,。DAPI 染核, ab7291 搭配ab150120 染微管蛋白（紅色）。
以下是我們關于固定劑選擇的建議：
· 大多數(shù)低分子量的蛋白質,、多肽和酶：對于細胞/細胞學樣本制備,，使用 4% 甲醛；對于組織切片,，使用 10% 中性福爾馬林緩沖（NBF）液,；
· 柔軟精細組織：Bouin 固定液；
· 氨基酸等小分子：4% 甲醛,；
· 造血器官（如肝,、脾、骨髓）：Zenker 固定液,；
· 結締組織：Helly 固定液,；
· 核酸：Carnoy 固定液；
· 大分子蛋白抗原（如免疫球）：冰浴丙酮或甲醇（100%）,；
· 細胞核形態(tài)：福爾馬林-硫酸鋅溶液,；
· 電鏡成像：4% 甲醛，1% 戊二醛溶液,。
4,、包埋和切片
固定組織后需立即處理,，以充分保證組織被切成厚度為 4-5 μm 。組織經脫水,、透明化,，然后浸蠟，以進行切片,。本方案包括
· 石蠟組織處理
· 冰凍組織包埋
· 乙二醇甲基丙烯酸酯 (Glycol methacrylate, GMA) 包埋
小結
希望您現(xiàn)在已經具備良好的前期基礎,，可以開始計劃您的 IHC 實驗。您應該對樣本制備有更多了解,，尤其是：IHC 樣本保存的兩種主要方法,，以及組織固定和包埋方法。
下周我們將介紹免疫組化染色原理以及抗原修復,、通透化和封閉,。