【用途】

本試劑盒采用實(shí)時(shí)熒光 PCR 方法檢測(cè)豬全血、血清,、淋巴結(jié),、脾臟,、腎臟、扁桃體,、肺,、肌肉等樣品及環(huán)境樣品中非洲豬瘟病毒（ASFV）的 DNA， 適用于 ASFV 的檢測(cè),、診斷和流行病學(xué)調(diào)查,。

【原理】

提取樣品DNA 作為模板，以引物為起點(diǎn)合成與DNA 模板互補(bǔ)的新鏈,，在熱啟動(dòng) Taq 酶的作用下,， 經(jīng)高溫變性、中溫退火及延伸的循環(huán),，使特異DNA 片段的拷貝數(shù)放大一倍,，經(jīng)熒光素標(biāo)記的探針與擴(kuò)增的 DNA 雜交，利用 Taq 聚合酶的 5'→3'外切活性,， 使熒光探針的報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離,，發(fā)出特異性熒光信號(hào)，利用熒光 PCR 儀檢測(cè)特異性熒光信號(hào),， 根據(jù)樣品Ct 值的大小及擴(kuò)增曲線的形成情況判定結(jié)果,。

【試劑盒組成】

組成	50 頭份	貯藏條件
陰性對(duì)照	1 mL	-20℃
陽(yáng)性對(duì)照	600 µL
無(wú)菌無(wú)核酸酶水	600 µL
PCR 反應(yīng)液	600 µL
熒光探針	105 µL
說(shuō)明書(shū)	1 份

【需要自備的器材】

1. 試劑：核酸提取試劑。

2. 儀器：離心機(jī),、熒光 PCR 擴(kuò)增儀,、-20℃冰箱、可調(diào)移液器（2µL,、20µL,、200µL、1000µL）,。

3. 耗材：熒光 PCR 反應(yīng)管,、吸頭（10µL、200µL ,、

1000µL）,。

【使用注意事項(xiàng)】

• 建議與世紀(jì)元亨提供的柱式 DNA 核酸提取試劑盒配套使用。
• 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中進(jìn)行陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照樣品的質(zhì)量控制,，需進(jìn)行提取,，建議提取用量分別為100µL。
• 所有接觸病料的物品均應(yīng)合理處置,，以免污染實(shí)驗(yàn)室。

4. PCR 整個(gè)試驗(yàn)分配液區(qū),、模板提取區(qū),、擴(kuò)增區(qū),。流程順序?yàn)榕湟簠^(qū)→模板提取區(qū)→擴(kuò)增區(qū)。嚴(yán)禁器材和試劑倒流,。

• 所有試劑應(yīng)在規(guī)定的溫度儲(chǔ)存,。-20℃保存的各試劑管使用前應(yīng)*融化，8000rpm 離心 15s,， 使液體全部沉于管底,，放于冰盒中，吸取液體時(shí)移液器吸頭盡量在液體表面層吸取,，使用后立即放回-20℃,。
• 注意防止試劑盒組分受污染。不要使用超過(guò)有效

期限的試劑,，試劑盒之間的成分不要混用,。

7. 嚴(yán)格遵守操作說(shuō)明可以獲得好的結(jié)果。操作過(guò)程中移液,、定時(shí)等全部過(guò)程必須精確,。

8. 反應(yīng)體系應(yīng)在特定配液區(qū)或者超凈工作臺(tái)中配制，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程嚴(yán)格控制污染,。

9. 反復(fù)凍融試劑將降低檢測(cè)靈敏度,，本試劑盒應(yīng)在

3 次內(nèi)用完。

【樣品采集】

病死或撲殺豬,，取脾臟,、淋巴結(jié)、腎臟,、扁桃體,、肺、肌肉等,；待檢活豬,，用注射器取血 5 mL； 或采集與病豬相關(guān)場(chǎng)所的糞便,、飼料,、污水等環(huán)境樣品。2～8 ℃保存,，送實(shí)驗(yàn)室檢測(cè),。（要求送檢病料新鮮，嚴(yán)禁反復(fù)凍融,。）

【實(shí)時(shí)熒光 PCR 操作】

設(shè)被檢樣品,、陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照總和為 N， 則反應(yīng)體系配制如下：

試劑	體系
無(wú)菌無(wú)核酸酶水	6.3×（N+1）µL
PCR 反應(yīng)液	10×（N+1）µL
熒光探針	1.7×（N+1）µL

將以上配制的反應(yīng)體系充分混勻后,，分裝每個(gè)反應(yīng)管中各 18 µL,。

分別取 2 µL 模板 DNA,，加入相應(yīng)反應(yīng)管中， 混勻并作好標(biāo)記,。在熒光 PCR 擴(kuò)增儀上進(jìn)行以下反應(yīng)：95 ℃ 2 min,；循環(huán) 95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s,，共 40 次,，每次循環(huán)的第二步（60 ℃ 35 s）收集熒光信號(hào)

（報(bào)告基團(tuán)“FAM”，淬滅基團(tuán)“None”）,。

【結(jié)果判定】

1. 結(jié)果分析條件設(shè)定

閾值設(shè)定原則：閾值線設(shè)定于剛好超過(guò)陰性對(duì)照擴(kuò)增曲線的高點(diǎn),。不同儀器可根據(jù)儀器噪音情況進(jìn)行調(diào)整。

2. 結(jié)果描述及判定

陽(yáng)性對(duì)照Ct 值＜30 并出現(xiàn)特異的擴(kuò)增曲線,，陰性對(duì)照無(wú)Ct 值且無(wú)特異的擴(kuò)增曲線,，實(shí)驗(yàn)結(jié)果成立。被檢樣品Ct 值＜35 并出現(xiàn)特異的擴(kuò)增曲線,，判為非洲豬瘟病毒核酸陽(yáng)性,；無(wú)Ct 值且無(wú)特異的擴(kuò)增曲線， 判為非洲豬瘟病毒核酸陰性,；35≤Ct 值＜40 并出現(xiàn)特異的擴(kuò)增曲線,，判為非洲豬瘟病毒核酸疑似，對(duì)疑似樣品,，需重新取樣提取 DNA,，進(jìn)行復(fù)檢，Ct 值＜40 判為陽(yáng)性,，否則判為陰性,；對(duì)于某些未呈現(xiàn)S 型曲線，但本底較高的樣品,，應(yīng)判定為陰性,。

【規(guī)格】50 頭份/盒

【保存及有效期】于-20℃以下保存，有效期為 12

個(gè)月,。