產(chǎn)品及特點(diǎn) | 馬鼻肺炎病毒(Equine Rhinopneumonitis Virus,，ERV)會(huì)引起馬鼻肺炎，又名馬病毒性流產(chǎn)，是馬的一種急性發(fā)熱性傳染病,，在自然條件下只感染馬屬動(dòng)物,。病馬和康復(fù)后的帶毒馬是傳染源，主要經(jīng)呼吸道傳染,，消化道及交配也可傳染,，可呈地方性流行，多發(fā)生于秋冬和早春,。妊娠母馬感染本病時(shí),，易發(fā)生流產(chǎn)；幼駒發(fā)病初期高熱,，體溫高達(dá)39.5-41℃,，可持續(xù)2-7天，同時(shí)可見(jiàn)鼻粘膜充血并流出漿液性鼻液,，頜下淋巴結(jié)腫大,，食欲稍減，體溫下降后可恢復(fù)正常,，若發(fā)病后調(diào)教或勞役過(guò)度,，易引起細(xì)菌繼發(fā)感染，發(fā)生肺炎和腸炎等,，造成死亡,。該病毒容易給馬場(chǎng)養(yǎng)殖業(yè)造成較大經(jīng)濟(jì)損失，因此馬鼻肺炎病毒的快速準(zhǔn)確鑒定對(duì)該病的預(yù)防和檢疫有著重要作用,，為此本公司開(kāi)發(fā)了簡(jiǎn)單快捷的馬鼻肺炎病毒染料法熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒,，它具有下列特點(diǎn)： - 即開(kāi)即用，用戶只需要提供病毒樣品,。
- 根據(jù)馬鼻肺炎病毒保守序列設(shè)計(jì)的專一性引物,，與相關(guān)病毒無(wú)交叉反應(yīng)。
- 靈敏度可以達(dá)到幾百拷貝/反應(yīng),。
- 一管式熒光定量PCR檢測(cè),，避免后續(xù)污染。
- 本試劑盒足夠50次20μL反應(yīng)體系的熒光定量PCR,。
- 本產(chǎn)品只適用于科研,，不能用于臨床診斷。
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使用方法 | 一、稀釋PCR陽(yáng)性對(duì)照（以10E2-10E7拷貝/μL這6個(gè)10倍稀釋度為例） - 注意：由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高,，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行,，千萬(wàn)不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原,，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽(yáng)性對(duì)照,，只提供可以直接使用的DNA片段作為陽(yáng)性對(duì)照。
- 標(biāo)記6個(gè)離心管,，分別為7,，6，5,，4,，3，2,。
- 用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR模板稀釋液（用帶芯槍頭,，下同）。
- 在7號(hào)管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照,，充分震蕩1分鐘,，得1×10E7拷貝/μL的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用,。
- 換槍頭,，在6號(hào)管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘,，得1×10E6拷貝/μL的陽(yáng)性對(duì)照,。放冰上待用。
- 換槍頭,，在5號(hào)管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL的陽(yáng)性對(duì)照到5號(hào)管中,，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的陽(yáng)性對(duì)照,。放冰上待用,。
- 重復(fù)上面的操作直到得到6個(gè)稀釋度的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用,。
二,、樣品DNA的制備 - 如果有N個(gè)樣品，必須設(shè)置N+2個(gè)提取,，多出的一個(gè)是PC（樣品制備陽(yáng)性對(duì)照）,，一個(gè)是NC（樣品制備陰性對(duì)照）?？梢杂?0μL上步制備的PCR陽(yáng)性對(duì)照的第4號(hào)（濃度為1×10E4 拷貝/μL,，10μL相當(dāng)于1萬(wàn)拷貝）或第5號(hào)（濃度為1×10E5 拷貝/μL,，10μL相當(dāng)于10萬(wàn)拷貝）再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC,。另外用水作為NC。如果每次制備需要200μL樣品,，則PC和NC的體積也必須是200μL,。
- 用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)病毒DNA提取試劑盒兼容,。也可以選購(gòu)本公司的一管式病毒DNAout或其升級(jí)版柱式病毒DNAout,。本試劑盒免費(fèi)贈(zèng)送15次一管式病毒DNAout，
三,、設(shè)置qPCR反應(yīng)（20 μL體系,，在樣品制備室進(jìn)行） - 如果只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+9個(gè)PCR管,，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品,，1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照，6個(gè)用于PCR陽(yáng)性對(duì)照,。如果做2-3次重復(fù),，則反應(yīng)設(shè)置數(shù)量相應(yīng)增加2或3倍。
- 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù),。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照,，并且陽(yáng)性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好后后加）：
成分 | 樣品管 N+2個(gè) | PCR陰性對(duì)照管 | PCR陽(yáng)性 對(duì)照管（2-7管） | 2×qPCR MagicMix （棕色管） | 10 μL | 10 μL | 各10 μL | 馬鼻肺炎病毒PCR 引物混合液（白蓋） | 2 μL | 2 μL | 各2 μL | 自備10×ROX (見(jiàn)注) | 2 μL | 2 μL | 各2 μL | N+2待測(cè)樣品DNA模板 | 6 μL | 不加 | 不加 | 第7步所得PCR陽(yáng)性對(duì)照 稀釋液（2-7號(hào)） | 不加 | 不加 | 各6μL（2號(hào)樣到2號(hào)管，3號(hào)樣到3號(hào)管…） |
注:僅ABI7500,、7700和7900儀器需要使用ROX作為對(duì)照,，其他熒光PCR儀器（如iCycler IQ、MJ Option,、MJ Chromo4,、MX3000、MX4000,、RotorGene 3000,、RotorGene 6000和LightCycler480）不需要使用ROX，則用水替代,。 - 蓋上蓋子后上機(jī),，按下面參數(shù)進(jìn)行PCR（具體PCR參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行優(yōu)化）。
過(guò)程 | 溫度 | 時(shí)間 | 預(yù)變性 | 92℃ | 5分鐘 | PCR反應(yīng) （30個(gè)循環(huán)） | 92℃ | 60 秒 | 56℃ | 60 秒 | 74℃ | 60 秒 |
具體操作按所用儀器推薦的流程進(jìn)行,。本產(chǎn)品中所含的熒光染料在不結(jié)合DNA時(shí),，大吸收光譜在471 nm，結(jié)合DNA時(shí)的大吸收光譜在500 nm,，大發(fā)射光譜在530 nm,。信號(hào)采集可以設(shè)置在復(fù)性或延伸步驟,。 - 如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以陽(yáng)性對(duì)照濃度的log值為橫軸,，以Ct值為縱軸,，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品DNA濃度的log值,，再推算出其濃度,。
- 如果把本試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽(yáng)性或陰性,，則陰性對(duì)照Ct必須大于或等于40,。陽(yáng)性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，有典型擴(kuò)增曲線,，Ct值應(yīng)該小于或等于30,。對(duì)待測(cè)樣品，如果其Ct大于或等于40則為陰性,，如果小于或等于35則為陽(yáng)性,。如果在35-40之間，則重復(fù)一次,。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的Ct值如果大于或等于40則為陰性,，如果小于40，則為陽(yáng)性,。
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