| 產(chǎn)品及特點 | 蜱傳腦炎病毒(Tick-borne Encephalitis Virus,，TBEV)是一種RNA病毒,，由蜱傳播，在春夏季節(jié)流行于俄羅斯及我國東北森林地帶,，非疫區(qū)易感人被帶有病毒的蜱叮咬后,，易感染發(fā)病，另外因喝生羊奶（羊感染時奶中有病毒或被蜱類污染）而被傳染,，約經(jīng)8～14天潛伏期后發(fā)生腦炎,，出現(xiàn)肌肉麻痹、萎縮,、昏迷致死,，少數(shù)*者也常肌肉麻痹。居住在森林疫區(qū)的發(fā)生腦炎,，出現(xiàn)肌肉麻痹,、萎縮、昏迷致死,，少數(shù)*者也常肌肉麻痹,，因此快速準(zhǔn)確鑒定對該病的預(yù)防和檢疫有著重要作用。本產(chǎn)品基于PCR原理開發(fā),。它具有下列特點： - 一站式,，用于不需要單獨準(zhǔn)備每種成分，包括引物和對照,。
- 根據(jù)蜱傳腦炎病毒的保守基因序列設(shè)計的引物,，具有良好的特異性。
- 基于染料法qRT-PCR檢測,，靈敏度比常規(guī)RT-PCR高10-100倍,，可以達到至少1000拷貝/反應(yīng)。
- 使用一管式qRT-PCR技術(shù),，RT和PCR兩步在一個試管內(nèi)完成，不需要中間轉(zhuǎn)移樣品,，降低了操作誤差和可能的污染,。
- 本產(chǎn)品足夠50次30μL體系的RT-PCR，只能用于科研,，不能用于臨床,。
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| 使用方法 | 一、稀釋陽性對照（以10E2-10E7這6個10倍稀釋度為例,。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高,，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原,。 - 標(biāo)記6個離心管,，分別為7，6,，5,，4，3,，2,。用帶芯槍頭分別加入45 μL 熒光PCR模板稀釋液，用帶芯槍頭,，下同）,。
- 在7號管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽性對照(本試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘,，得1×10E7拷貝/μL的陽性對照,。放冰上待用。
- 換槍頭,，在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的陽性對照,。放冰上待用,。
- 換槍頭，在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),，充分震蕩1分鐘,，得1×10E5拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用,。重復(fù)上面的操作直到得到6個稀釋度的陽性對照,。放冰上待用。
二,、樣品RNA的制備 - 如果有N個樣品,，必須設(shè)置N+2個提取,，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照），一個是NC（樣品制備陰性對照）,?？梢杂?0μL上步制備的陽性對照梯度稀釋液中的第4號（濃度為1×10E4拷貝/μL，10μL相當(dāng)于1萬拷貝）再加上一定量的水作為制備的陽性對照（加水后其總體積跟樣品一樣,，樣品體積多少取決于所用試劑盒的要求）,。可以用水作為制備的陰性對照,。
- 用自選方法純化N+2個樣品的RNA,，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒RNA提取試劑盒兼容。本試劑盒免費贈送20次免RNA提取的天凈沙核酸釋放劑試用裝,，
三,、設(shè)置RT-PCR反應(yīng)（20μL體系，在樣品制備室進行） - 如果做定量分析并且只做1次重復(fù),，則標(biāo)記N+9個PCR管,，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照,，6個用于標(biāo)準(zhǔn)曲線,。如果做定性分析，并且只做1次重復(fù),，則標(biāo)記N+4個PCR管,，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照（用水做模板）,，1個用于PCR陽性對照（用第4號陽性對照稀釋液做模板）,。下面只描述定量分析的步驟，定性分析只是把6個標(biāo)曲反應(yīng)縮減成1個,，其余不變,。
- 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照,，陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子后后加）：
成分 | N+2個制備所得樣品 | RT-PCR陰性對照 | RT-PCR陽性 對照（2-7管） | 2×qRT-PCR 緩沖液 | 10μL | 10μL | 各10μL | 口蹄疫病毒RT-PCR 引物混合物 | 2μL | 2μL | 各2μL | 50×ROX (見注) | 0.4μL | 0.4μL | 各0.4μL | 樣品制備所得RNA模板（來于第8步） | 5.6μL | 不加 | 不加 | 稀釋所得6個陽性對照（來于第6步） | 不加 | 不加 | 各5.6μL（2號樣到2號管,，3號樣到3號管…） | 10×qRT-PCR 酶混合液 | 2μL | 2μL | 2μL |
注:需使用ROX染料I的機型：ABI Prism7000、7300,、7700,、7900HT、Step-One,、Step-One Plus,。 需使用ROX染料II的機型：：ABI Prism 7500、7500Fast,、MJ Research的Chromo4、Opticon（II）Corbett Rotor Gene 3000。 不需要使用ROX的機型：Thermal Cycle Dice Real Time System,， LightCycler,、Smart Cycler System、Agilent Mx3000P,、RotorGene 3000,、RotorGene 6000。 - 上機后按下面參數(shù)進行RT-PCR（參數(shù)可能會因儀器不同而需優(yōu)化）,。
過程 | 溫度 | 時間 | RT（逆轉(zhuǎn)錄） | 50℃ | 15-30分鐘 | 預(yù)變性 | 94℃ | 2分鐘 | RT - PCR反應(yīng) （30個循環(huán)） | 95℃ | 15 秒 | 60℃ | 15 秒（采集FAM通道的熒光信號） | 72℃ | 15 秒 | 按儀器預(yù)設(shè)程序進行溶解曲線分析 |
- 如果把本試劑盒用于定量檢測,，則以陽性對照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸,，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,。再以待測樣品的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品RNA濃度的log值，再推算出其濃度,。
- 如果把本試劑盒用于定性檢測,，只判斷陽性或陰性，則陰性對照Ct必須大于或等于40,。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長,，有典型擴增曲線，Ct值應(yīng)該小于或等于30,。對待測樣品,，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于35則為陽性,。如果在35-40之間,，則重復(fù)一次。重復(fù)實驗的Ct值如果大于或等于40則為陰性,，如果小于40,，則為陽性。
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