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準(zhǔn)備工作

（1）試管,、試管架,、滴管、吸管,、小鼠固定架,、玻璃瓶、玻璃皿,、燒杯,、橡皮頭、剪刀,、鑷子,、紗布、棉球,、酒精燈,、滴管、移液器,、細(xì)胞計(jì)數(shù)器,、生理鹽水,、PBS、雙抗（青鏈霉素）,、75%酒精,、95%酒精、培養(yǎng)瓶（50ml,，260ml）,。

（2）BALB/C小鼠（4~5周齡，18~22g,，雌雄不限）,、胎牛血清（滅活）、DMEM-LG培養(yǎng)液（美國(guó)GIBCO）

（3）針頭與注射器：4.5號(hào),、7號(hào)針頭（沖小鼠股骨,、脛骨和肱骨骨髓，制單細(xì)胞懸液）,。

實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

（1）實(shí)驗(yàn)室消毒,，隔離衣消毒，小鼠固定架消毒,。配10%FBS培養(yǎng)液,，加雙抗（內(nèi)含青霉素、鏈霉素各100μg/ml）,。

（2）用75% 酒精擦拭無(wú)菌操作臺(tái)面,，取各種已消毒的培養(yǎng)用品置于超凈臺(tái)面，無(wú)菌室及超凈臺(tái)用紫外燈照射30~60 分鐘滅菌,。

（3）開始工作前先洗手,、75%酒精擦拭手至肘部。穿隔離衣,，戴手套,。用70% 酒精擦拭無(wú)菌操作臺(tái)面，并開啟無(wú)菌操作臺(tái)風(fēng)機(jī)運(yùn)轉(zhuǎn)10 分鐘后,，才可開始實(shí)驗(yàn)操作,。點(diǎn)燃酒精燈，安裝吸管帽,。

實(shí)驗(yàn)步驟

（1）BALB/C純系小鼠脫臼處死后,，75%乙醇浸泡5min后，在無(wú)菌操作臺(tái)上無(wú)菌條件下分離雙側(cè)股骨及脛骨,，在含生理鹽水的50mm2玻璃平皿中去除股骨周圍肌肉組織,，剪去包括骺板在內(nèi)的兩側(cè)骺端，用10ml注射器（配4.5號(hào)針頭）抽取適量含10%FBS的*培養(yǎng)基沖洗骨髓腔,，將骨髓沖入培養(yǎng)瓶,。依次用7號(hào)針頭和4.5號(hào)針頭（或依次過(guò)21、23,、25號(hào)）反復(fù)吹打骨髓細(xì)胞懸液,，制成單細(xì)胞懸液。細(xì)胞懸液在1000rpm離心5min后收集細(xì)胞或進(jìn)行密度梯度離心,。

（2）將單細(xì)胞懸液于1:2比例加到含1.082比重Percoll細(xì)胞分離液的離心管中,，4℃條件下，經(jīng)500g密度梯度離心25min,，小心收集離心液界面上乳白色云霧狀的單核細(xì)胞層,，加入等量無(wú)血清培養(yǎng)基或磷酸鹽緩沖液（PBS）充分洗滌（500g離心5min或180g離心10min）2次，去上清,，用10%FBS的培養(yǎng)基懸浮細(xì)胞（用0.83%氯化胺破碎紅細(xì)胞,，培養(yǎng)液重懸細(xì)胞）。注意：密度梯度離心力500g×30min組優(yōu)于800g×30min,。本步驟可以省略,。

附：人骨髓：抽取骨髓10-15ml（或正常人手術(shù)肋骨取骨髓3-5ml），每毫升骨髓加100u 肝素抗凝,，充分混勻后,，保存于4℃冰箱，24小時(shí)內(nèi)分離骨髓MNC,。骨髓先加入等量 PBS或Hanks液（或培養(yǎng)液）混勻后,，以1份淋巴細(xì)胞分離液上面加2份稀釋骨髓的比例，將稀釋骨髓緩慢加入ficoll液面上（密度1.077）,，水平離心機(jī)20℃條件下500g（2000r/min）離心25~30分鐘,。從界面上取出的MNC用PBS液洗滌2~3次后，加適量培養(yǎng)液計(jì)數(shù),。

（3）數(shù)細(xì)胞數(shù)量,，達(dá)到106~107/ml后即進(jìn)行原代培養(yǎng)，按5×106/ml濃度接種于50ml培養(yǎng)瓶中（1×106/cm2培養(yǎng)瓶）,，每瓶含5ml L-DMEM*培養(yǎng)液,。在體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2和37℃條件下靜止培養(yǎng)，3d后換液去除非貼壁細(xì)胞,，以后每3~4d半量換液1次,，10~12d細(xì)胞達(dá)90%融合時(shí)傳代。

（4）傳代培養(yǎng)：傳代時(shí)先全部吸出培養(yǎng)液后,，用無(wú)Ca2+ ,、Mg2+PBS液洗滌二次，加入37℃預(yù)熱的0.25%（2.5g/L,，0.25%）胰蛋白酶（含1mmol/L EDTA,，即用1mmol/L-EDTA-Na2配制）消化1~2分鐘,，吸去胰酶，以殘留的胰酶繼續(xù)消化,，倒置顯微鏡下觀察,，細(xì)胞開始皺縮時(shí)（細(xì)胞開始變圓）加入*培養(yǎng)液（3ml左右）終止胰酶作用。吸管反復(fù)吹打后將細(xì)胞收集于15ml離心管中,，1500r/min 離心10分鐘后棄上清,，再用PBS液洗滌二次*洗去混有的胰蛋白酶。

將細(xì)胞再懸浮于培養(yǎng)液中,，按2~5×105/ml再次接種傳代于新的培養(yǎng)瓶中,。當(dāng)這些細(xì)胞生長(zhǎng)接近融合層時(shí)，即得到骨髓MSC,。傳至3~5代的MSC按1×105cells/cm2密度接種于放置有蓋玻片的6孔板內(nèi),，以制備細(xì)胞爬片。

注：貼壁細(xì)胞的消化,，應(yīng)掌握各類型細(xì)胞不同的消化時(shí)間,，避免過(guò)度消化，損傷細(xì)胞活力,；或消化不足,，不能充分解離成單細(xì)胞。如為長(zhǎng)期實(shí)驗(yàn),，每個(gè)月重新復(fù)蘇一支細(xì)胞,，避免長(zhǎng)期傳代引起細(xì)胞特性變異。