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煙曲霉探針法熒光定量 PCR 試劑盒
閱讀：376 發(fā)布時(shí)間：2019-9-19產(chǎn)品及特點(diǎn) 煙曲霉(Aspergillus fumigatus.)屬殼霉目、杯霉科,、煙曲霉屬,，是一種重
要的致病菌，也是引起食品的一種真菌,。煙曲霉的菌落生長(zhǎng)迅速,，絨狀或作
一定的絮狀，暗煙綠色,，老后色變得更深,。此菌嗜高溫，在 45℃或更高的溫度下
生長(zhǎng)茂盛,。在糧食發(fā)熱霉變的中期和后期常大量出現(xiàn),，促進(jìn)糧溫的升高和敗壞。
煙曲霉能寄生在人,、鳥類及其它脊椎動(dòng)物的肺部引起結(jié)核癥,。也能侵染棉鈴和蘋
果等，引起果實(shí)腐爛,，或寄藏于種子上,。因此快速檢測(cè)煙曲霉具有重要意義。本
產(chǎn)品就是以探針法熒光定量 PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測(cè)煙曲霉的試劑盒,，它
具有下列特點(diǎn)：
1. 即開即用,，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。
2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化,，靈敏性高,。
3. 提供陽(yáng)性對(duì)照，便于區(qū)分假陰性樣品,。
4. 特異性高,，引物是根據(jù)煙曲霉高度保守區(qū)設(shè)計(jì)，不會(huì)跟其他微生物的 DNA 發(fā)
生交叉反應(yīng),。
5. 本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應(yīng),。
6. 本產(chǎn)品只能用于科研。 規(guī)格及成分 成分 編號(hào) 十孔盒包裝
2×Probe qPCR MagicMix 190303 0.5 mL（本色蓋）
熒光 PCR 模板稀釋液 180701 1 mL（亮黃蓋）
煙曲霉 qPCR 引物 15-26720yw 100 μL（白蓋）
煙曲霉 qPCR 探針 15-26720pb 50 μL（棕色管）
煙曲霉 qPCR 陽(yáng)性對(duì)照
2.0(1×10E8 拷貝/μL)
60908-26720pc 50 μL（黃蓋）
天凈沙核酸釋放劑試用裝 61202 20 次（1mL,，綠蓋）
使用手冊(cè) 15-26720sc 1 份
運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸,，-20℃保存，保存期限為 12 個(gè)月,。 自備試劑 樣品 DNA,。 使用方法 一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例）。由
于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高,，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行,，千萬(wàn)不能污
染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原,，本
產(chǎn)品不提供活體樣品做陽(yáng)性對(duì)照,，只提供無(wú)傳染性的 DNA 片段作為陽(yáng)性對(duì)照。
1. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管,，分別為 7,，6，5,，4,，3，2,。
2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液,，用帶芯槍頭，
下同）,。
3. 在 7 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(試劑盒提供)，充分
震蕩 1 分鐘,，得 1×10E7 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用。
4. 換槍頭,，在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所
得),，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用,。
5. 換槍頭，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所
得),，充分震蕩 1 分鐘,，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用,。
6. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用。
二,、樣品 DNA 的制備
7. 如果有 N 個(gè)樣品,，設(shè)置 N+2 個(gè)提取，多出的一個(gè)是 PC（樣品制備陽(yáng)性對(duì)
照）,，一個(gè)是 NC（樣品制備陰性對(duì)照）,。可以用 10μL 陽(yáng)性對(duì)照的 10000 倍
稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣,，以此作為
PC,。另外用水作為 NC,。
8. 用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)真菌 DNA 提取試劑盒
兼容,。也可以選購(gòu)本公司的真菌 DNAout 或柱式真菌 DNAout,。本試劑盒免費(fèi)
贈(zèng)送 20 次免 DNA 提取的天凈沙核酸釋放劑，本產(chǎn)品的裂解液可以直接作為
PCR 模板,，省略了 DNA 提取步驟,。
三、Probe qPCR 反應(yīng)（20μL 體系,，在樣品制備室進(jìn)行）
9. 如果進(jìn)行定量分析,，則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2
個(gè)樣品,，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照,，6 個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。如果做定性分析,，
則 6 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品只選一個(gè)做（可以選 4 號(hào),，其余樣品不變）。以下只介
紹定量分析的反應(yīng)設(shè)置,。
10. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù),。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)
置完畢后才設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照，并且陽(yáng)性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好
后后加）：
成分
樣品管
N+2 個(gè)
PCR陰性對(duì)
照管
標(biāo)準(zhǔn)曲線
樣品管（2-7 管）
2×Probe qPCR MagicMix 10 μL 10 μL 各 10 μL
煙曲霉 qPCR 探針 1 μL 1 μL 各 1 μL
煙曲霉 qPCR
引物混合液
2 μL 2 μL 各 2 μL
N+2 個(gè)待測(cè)樣品 DNA 模板 6 μL 不加 不加
自備超純水 不加 6 μL 不加
第 7 步所得標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品稀釋液
（2-7 號(hào)）
不加 不加
各 6μL（2 號(hào)樣到 2
號(hào)管,，3 號(hào)樣到 3 號(hào)
管…）
11. 蓋上蓋子后上機(jī),，按下面參數(shù)進(jìn)行 PCR：
過程 溫度 時(shí)間
預(yù)變性 94℃ 5 min
PCR 反應(yīng)
（40 個(gè)循環(huán)）
94℃ 0.5 min
55℃
0.5 min（采集 FAM 通道的熒光
信號(hào)）
72℃ 0.5 min
五、數(shù)據(jù)處理
12. 如果把本試劑盒用于定量檢測(cè),，則以陽(yáng)性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸,，以 Ct
值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,。再以待測(cè)樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品
DNA 濃度的 log 值,，再推算出其濃度。
13. 如果把本試劑盒用于定性檢測(cè),，只判斷陽(yáng)性或陰性,，則陰性對(duì)照 Ct 必須大
于或等于 40。陽(yáng)性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng),，有典型擴(kuò)增曲線,，Ct 值應(yīng)該
小于或等于 30。對(duì)待測(cè)樣品,，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性,，如果小于
或等于 35 則為陽(yáng)性。如果在 35-40 之間，則重復(fù)一次,。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的 Ct 值如
果大于或等于 40 則為陰性,，如果小于 40，則為陽(yáng)性,。 關(guān)聯(lián)產(chǎn)品 煙曲霉 LAMP 檢測(cè)試劑盒