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PriCells: 動(dòng)物淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的分離

基本方案1：灌注消化法

實(shí)驗(yàn)材料：

1. 哺乳動(dòng)物胸導(dǎo)管淋巴管

2. 1×PBS,，含青霉素100u/ml和鏈霉素100μg/ml，pH7.4

3. 0.2%Ⅰ型膠原酶

4. 眼科剪,，眼科鑷

5. 慕絲線（7號(hào)線）,、細(xì)鐵絲

6. 離心管（15ml,、50ml）

實(shí)驗(yàn)方法：

1. 處死動(dòng)物后,，打開(kāi)胸腔,，分離胸導(dǎo)管，在胸導(dǎo)管上端結(jié)扎,，切取10-15cm的一段,。將胸導(dǎo)管放入預(yù)冷PBS中漂洗。

2. 在解剖顯微鏡下,，用眼科剪和眼科鑷剝除外膜的脂肪和纖維組織,，然后用PBS反復(fù)沖洗管腔。

3. 將胸導(dǎo)管移入含PBS的大培養(yǎng)皿中，清洗3次,。在胸導(dǎo)管的遠(yuǎn)端插入靜脈留置針,，并結(jié)扎固定。用PBS沖洗管腔后,，將游離端結(jié)扎,。用靜脈留置針向管腔內(nèi)注入消化液，至淋巴管充盈為止,。在37℃條件下,，消化10min,。淋巴管的管壁較薄,，灌注消化時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，以免消化過(guò)度,，引起成纖維細(xì)胞的污染,。

4. 取出胸導(dǎo)管，在游離端剪一小口,，用離心管收集消化液,，然后用培養(yǎng)液沖洗管腔，收集消化液和沖洗液,，以1000r/min,，離心10min。離心后吸去上清液,，用培養(yǎng)液輕輕混懸細(xì)胞,。

5. 將細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24h后補(bǔ)充培養(yǎng)液,，繼續(xù)培養(yǎng),。每隔2-3d換液1次。換液時(shí),，吸去1/2-2/3培養(yǎng)液,，再加入新鮮培養(yǎng)液。

6. 原代培養(yǎng)4-6h后,，大部分細(xì)胞已貼壁生長(zhǎng),。24h后，內(nèi)皮細(xì)胞形成由數(shù)個(gè)細(xì)胞組成的細(xì)胞群,。淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的活性較低,，原代培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢。2-3周后,，細(xì)胞生長(zhǎng)形成單層,。淋巴管內(nèi)皮單層呈卵石狀特征性排列，可傳代培養(yǎng)。

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