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細(xì)胞原代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)之胰酶消化法
閱讀：1082 發(fā)布時(shí)間：2019-9-18實(shí)驗(yàn)方法原理 將動(dòng)物機(jī)體的各種組織從機(jī)體中取出,，經(jīng)各種酶（常用胰蛋白酶）,、螯合劑（常用EDTA）或機(jī)械方法處理,，分散成單細(xì)胞,，置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng),，使細(xì)胞得以生存、生長(zhǎng)和繁殖,，這一過(guò)程稱(chēng)原代培養(yǎng),。因此，較為嚴(yán)格地說(shuō)是指成功傳代之前的培養(yǎng),，此時(shí)的細(xì)胞保持原有細(xì)胞的基本性質(zhì),，如果是正常細(xì)胞，仍然保留二倍體數(shù),。但實(shí)際上,，通常把代至第十代以?xún)?nèi)的培養(yǎng)細(xì)胞統(tǒng)稱(chēng)為原代細(xì)胞培養(yǎng)。常用的原代培養(yǎng)有組織塊培養(yǎng)和分散細(xì)胞培養(yǎng),。
實(shí)驗(yàn)材料 胎鼠新生鼠
試劑,、試劑盒 1640培養(yǎng)基牛血清胰酶Hank’s液碘酒
儀器、耗材 培養(yǎng)箱培養(yǎng)瓶青霉素瓶小玻璃漏斗平皿吸管移液管紗布手術(shù)器械血球計(jì)數(shù)板離心機(jī)水浴箱
實(shí)驗(yàn)步驟
一,、實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備
1. Hank's液配方：KH2PO4 0.06 g,，Nacl 8.0 g，NaHCO3 0.35 g,，KCl 0.4 g,，葡萄糖1.0 g，Na2HPO4·H2O 0.06 g,，加H2O至 1 000 ml,。Hank's液可以高壓滅菌。4℃下保存,。
二,、具體操作
1. 將孕鼠或新生小鼠拉頸椎致死，置75%酒精泡2-3秒鐘（時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng),、以免酒精從口和肛門(mén)浸入體內(nèi)）再用碘酒消毒腹部,，取胎鼠帶入超凈臺(tái)內(nèi)（或?qū)⑿律∈笤诔瑑襞_(tái)內(nèi)）解剖取肝臟，置平皿中,。
2. 用Hank's液洗滌三次,，并剔除脂肪,，結(jié)締組織，血液等雜物,。
3. 用手術(shù)剪將肝臟剪成小塊（1 mm2）,，再用Hank's液洗三次，轉(zhuǎn)移至小青霉素瓶中,。
4. 視組織塊量加入5-6倍的0.25%胰酶液,，37℃中消化20-40分鐘，每隔5分鐘振蕩一次,，或用吸管吹打一次,，使細(xì)胞分離。
5. 加入3-5 ml培養(yǎng)液以終止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制劑）,。
6. 靜置5-10分鐘,，使未分散的組織塊下沉，取懸液加入到離心管中,。
7. 1 000 rpm,，離心10分鐘，棄上清液,。
8. 加入Hank's液5 ml,，沖散細(xì)胞，再離心一次,，棄上清液,。
9. 加入培養(yǎng)液1-2 ml（視細(xì)胞量），血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),。
10. 將細(xì)胞調(diào)整到5x105/ml左右,，轉(zhuǎn)移至25 ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37℃下培養(yǎng),。
收起
注意事項(xiàng)
1. 自取材開(kāi)始,，保持所有組織細(xì)胞處于無(wú)菌條件。細(xì)胞計(jì)數(shù)可在有菌環(huán)境中進(jìn)行,。
2. 在超凈臺(tái)中,，組織細(xì)胞、培養(yǎng)液等不能暴露過(guò)久,，以免溶液蒸發(fā),。
3. 凡在超凈臺(tái)外操作的步驟，各器皿需用蓋子或橡皮塞,，以防止細(xì)菌落入,。
4. 操作前要洗手，進(jìn)入超凈臺(tái)后手要用75%酒精或0.2%新潔爾滅擦試。試劑等瓶口也要擦試,。
5. 點(diǎn)燃酒精燈,，操作在火焰附近進(jìn)行，耐熱物品要經(jīng)常在火焰上燒灼,，金屬器械燒灼時(shí)間不能太長(zhǎng),，以免退火，并冷卻后才能夾取組織,，吸取過(guò)營(yíng)養(yǎng)液的用具不能再燒灼，以免燒焦形成碳膜,。
6. 操作動(dòng)作要準(zhǔn)確敏捷,，但又不能太快，以防空氣流動(dòng),，增加污染機(jī)會(huì),。
7. 不能用手觸已消毒器皿的工作部分，工作臺(tái)面上用品要布局合理,。
8. 瓶子開(kāi)口后要盡量保持45°斜位,。
9. 吸溶液的吸管等不能混用。