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實(shí)時熒光定量PCR?。?/h3>
閱讀：435 發(fā)布時間：2019-9-18
實(shí)時熒光定量PCR
一種科學(xué)準(zhǔn)確的定量方法
實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國Applied Biosystems公司推出,，由于該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比,，它具有特異性更強(qiáng),、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點(diǎn),，目前已得到廣泛應(yīng)用,。本文試就其定量原理、方法及參照問題作一介紹,。
一. 實(shí)時熒光定量PCR原理
所謂實(shí)時熒光定量PCR技術(shù),，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程,，后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法,。
1. Ct 值的定義
在熒光定量PCR技術(shù)中，有一個很重要的概念 —— Ct值,。C代表Cycle,，t代表threshold，Ct值的含義是：每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù),。
2. 熒光域值（threshold）的設(shè)定
PCR反應(yīng)的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號,，熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，即：threshold = 10 ´ SDcycle 6-15
3. Ct值與起始模板的關(guān)系
研究表明,，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系〔1〕,，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小,。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標(biāo)代Ct值,。因此,，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù),。
4. 熒光化學(xué)
熒光定量PCR所使用的熒光化學(xué)可分為兩種：熒光探針和熒光染料〔2〕?，F(xiàn)將其原理簡述如下：
1）TaqMan熒光探針：
PCR擴(kuò)增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸,，兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團(tuán)和一個淬滅熒光基團(tuán),。
探針完整時,，報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時,，Taq酶的5’－3’外切酶活性將探針酶切降解,，使報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號,，即每擴(kuò)增一條DNA鏈,，就有一個熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步,。
2）SYBR熒光染料：
在PCR反應(yīng)體系中,，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后,，發(fā)射熒光信號,，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加*同步,。
二．內(nèi)標(biāo)在傳統(tǒng)定量中的意義
1．幾種傳統(tǒng)定量PCR方法簡介〔3〕：
1）內(nèi)參照法：
在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物,，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記,，下游引物不標(biāo)記,。在模板擴(kuò)增的同時，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增,。在PCR產(chǎn)物中,，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或液相分離開來,，分別測定其熒光強(qiáng)度,，以內(nèi)標(biāo)為對照定量待檢測模板〔4〕。
2）競爭法：
選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競爭性模板,。在同一反應(yīng)管中,，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴(kuò)增（其中一個引物為熒光標(biāo)記）。
擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物,，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段,，而待測模板不被酶切，可通過電泳或液相將兩種產(chǎn)物分開,，分別測定熒光強(qiáng)度,，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)〔5〕。
3）PCR－ELISA法：
利用或生物素等標(biāo)記引物,，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物,，終酶使底物顯色,。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn),，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測目的〔6〕,。
2．內(nèi)標(biāo)在傳統(tǒng)定量中的作用
由于傳統(tǒng)定量方法都是終點(diǎn)檢測，即PCR到達(dá)平臺期后進(jìn)行檢測,，而PCR經(jīng)過對數(shù)期擴(kuò)增到達(dá)平臺期時,，檢測重現(xiàn)性極差。
同一個模板在96孔PCR儀上做96次重復(fù)實(shí)驗(yàn),，所得結(jié)果有很大差異,，因此無法直接從終點(diǎn)產(chǎn)物量推算出起始模板量。加入內(nèi)標(biāo)后,，可部分消除終產(chǎn)物定量所造成的不準(zhǔn)確性,。但即使如此，傳統(tǒng)的定量方法也都只能算作半定量,、粗略定量的方法,。
三．內(nèi)標(biāo)對熒光定量PCR的影響
1．實(shí)時熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)
實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強(qiáng)度,，并記錄在電腦軟件之中,，通過對每個樣品Ct值的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果,。因此,，實(shí)時熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個基礎(chǔ)之上的：
1）Ct值的重現(xiàn)性
PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對數(shù)期）,，此時微小誤差尚未放大,，因此Ct值的重現(xiàn)性*，即同一模板不同時間擴(kuò)增或同一時間不同管內(nèi)擴(kuò)增,，得到的Ct值是恒定的,。
2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系
由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進(jìn)行定量測定,，因此,，實(shí)時熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。
2．內(nèi)標(biāo)對實(shí)時熒光定量PCR的影響
若在待測樣品中加入已知起始拷貝數(shù)的內(nèi)標(biāo),，則PCR反應(yīng)變?yōu)殡p重PCR,，雙重PCR反應(yīng)中存在兩種模板之間的干擾和競爭，尤其當(dāng)兩種模板的起始拷貝數(shù)相差比較大時,，這種競爭會表現(xiàn)得更為顯著〔7,8〕,。
但由于待測樣品的起始拷貝數(shù)是未知的，所以無法加入合適數(shù)量的已知模板作為內(nèi)標(biāo),。也正是這個原因,，傳統(tǒng)定量方法雖然加入內(nèi)標(biāo),，但仍然只是一種半定量的方法。
美國Texas大學(xué)的科研人員進(jìn)行了外標(biāo)法定量和內(nèi)標(biāo)法定量的方法學(xué)比較,，得出的結(jié)論是：內(nèi)標(biāo)法作為定量或半定量的手段是不可靠的,，而外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方〔9〕,。
Applied Biosystems公司的7700型實(shí)時熒光定量PCR儀是*的熒光定量PCR的金標(biāo)準(zhǔn),，可實(shí)現(xiàn)多色熒光同時檢測，但定量檢測仍然采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法,，而不用內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量,。
綜上所述，利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時熒光定量PCR是迄今為止定量準(zhǔn)確,，重現(xiàn)性的定量方法,，已得到*的*，廣泛用于基因表達(dá)研究,、轉(zhuǎn)基因研究,，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域〔10,11,12,13〕,。
參考文獻(xiàn)
1. Higuchi R, Fockler C, etal. Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology, 1993, 11(9): 1026-1030.
2. DNA/RNA Real-Time Quantitative PCR-Rev. B Applied Biosystems
3. 定量聚合酶鏈反應(yīng)的研究進(jìn)展與臨床應(yīng)用. 中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志2000, 23(2): 120-121.
4. Anderson KM, Cheung PH, Kell MD. Rapid generation of homologous internal standards and evaluation of data for quantitaion of messenger RNA by competitive polymerase chain reaction. J Pharmacol Toxicol Methods, 1997, 38: 133-140.
5. Wuhu A, Waiztu M, Koch A. A rapid and sensitive protocol for competitive reverse transcriprase (CRT) PCR analysis of cellular genes. Brain Pathol, 1998, 8: 13-18
6. 仝文斌,，高巍，費(fèi)然等. 核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的量化酶免疫通用型檢測方法. 中華醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志,，1999, 22: 83-86.
7. Actor JK, Limor JR, Hunter RL. A flexible bioluminescent-quantitive polymerase reaction assay for analysis of competitive PCR amplicons. J Clin Lab Anal, 1999, 13(1): 40-47.
8. Schnell S, Mendoza C. Enzymological considerations for a theoretical description of the quantitative competitive polymerase chain reaction(QC-PCR). J Theor Biol, 1997, 184(4): 433-440.
9. Ke LD, Chen Z, Yung WK. A reliability test of standard-based quantitative PCR: exogenous vs endogenous standards. Mol. Cell Probes, 2000, 14(2): 127-135.
10. Becker K., D. Pan and C.B.Whitely. Real-time quantitative polymerase chain reaction to assess gene transfer. Hum. Gene Ther, 1999, 10: 2559-2566.
11. Higgis, J.A., etal. 5’ nuclease PCR assay to detect Yersinia pesits. J Clin Microbiol, 1998, 36: 2284-2288.
12. Bieche I., P.Oondy, etal. Real-time reverse transcription-PCR assay for future nagement of ERBB2-based clinical apolications. Clin.Chem, 1999, 45: 1148-1156.
13. Wang X. X. Li, etal. Application of real-time polymerase chain reaction to quantitate induced expression of interleukin-1 beta mRNA in ischemic brain tolerance. 2000,Neurosci.Res, 59(2): 238-46
實(shí)時熒光定量PCR
一種科學(xué)準(zhǔn)確的定量方法
實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國Applied Biosystems公司推出,，由于該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比,，它具有特異性更強(qiáng),、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點(diǎn),，目前已得到廣泛應(yīng)用,。本文試就其定量原理、方法及參照問題作一介紹,。
一. 實(shí)時熒光定量PCR原理
所謂實(shí)時熒光定量PCR技術(shù),，是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程,，后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法,。
1. Ct 值的定義
在熒光定量PCR技術(shù)中，有一個很重要的概念 —— Ct值,。C代表Cycle,，t代表threshold，Ct值的含義是：每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù),。
2. 熒光域值（threshold）的設(shè)定
PCR反應(yīng)的前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號,，熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍，即：threshold = 10 ´ SDcycle 6-15
3. Ct值與起始模板的關(guān)系
研究表明,，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系〔1〕,，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小,。利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)，縱坐標(biāo)代Ct值,。因此,，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù),。
4. 熒光化學(xué)
熒光定量PCR所使用的熒光化學(xué)可分為兩種：熒光探針和熒光染料〔2〕?，F(xiàn)將其原理簡述如下：
1）TaqMan熒光探針：
PCR擴(kuò)增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸,，兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團(tuán)和一個淬滅熒光基團(tuán),。
探針完整時,，報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時,，Taq酶的5’－3’外切酶活性將探針酶切降解,，使報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號,，即每擴(kuò)增一條DNA鏈,，就有一個熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步,。
2）SYBR熒光染料：
在PCR反應(yīng)體系中,，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后,，發(fā)射熒光信號,，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加*同步,。
二．內(nèi)標(biāo)在傳統(tǒng)定量中的意義
1．幾種傳統(tǒng)定量PCR方法簡介〔3〕：
1）內(nèi)參照法：
在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物,，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記,，下游引物不標(biāo)記,。在模板擴(kuò)增的同時，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增,。在PCR產(chǎn)物中,，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或液相分離開來,，分別測定其熒光強(qiáng)度,，以內(nèi)標(biāo)為對照定量待檢測模板〔4〕。
2）競爭法：
選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競爭性模板,。在同一反應(yīng)管中,，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴(kuò)增（其中一個引物為熒光標(biāo)記）。
擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物,，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段,，而待測模板不被酶切，可通過電泳或液相將兩種產(chǎn)物分開,，分別測定熒光強(qiáng)度,，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)〔5〕。
3）PCR－ELISA法：
利用或生物素等標(biāo)記引物,，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物,，終酶使底物顯色,。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn),，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線,，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測目的〔6〕,。
2．內(nèi)標(biāo)在傳統(tǒng)定量中的作用
由于傳統(tǒng)定量方法都是終點(diǎn)檢測，即PCR到達(dá)平臺期后進(jìn)行檢測,，而PCR經(jīng)過對數(shù)期擴(kuò)增到達(dá)平臺期時,，檢測重現(xiàn)性極差。
同一個模板在96孔PCR儀上做96次重復(fù)實(shí)驗(yàn),，所得結(jié)果有很大差異,，因此無法直接從終點(diǎn)產(chǎn)物量推算出起始模板量。加入內(nèi)標(biāo)后,，可部分消除終產(chǎn)物定量所造成的不準(zhǔn)確性,。但即使如此，傳統(tǒng)的定量方法也都只能算作半定量,、粗略定量的方法,。
三．內(nèi)標(biāo)對熒光定量PCR的影響
1．實(shí)時熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)
實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強(qiáng)度,，并記錄在電腦軟件之中,，通過對每個樣品Ct值的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果,。因此,，實(shí)時熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個基礎(chǔ)之上的：
1）Ct值的重現(xiàn)性
PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對數(shù)期）,，此時微小誤差尚未放大,，因此Ct值的重現(xiàn)性*，即同一模板不同時間擴(kuò)增或同一時間不同管內(nèi)擴(kuò)增,，得到的Ct值是恒定的,。
2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系
由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進(jìn)行定量測定,，因此,，實(shí)時熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。
2．內(nèi)標(biāo)對實(shí)時熒光定量PCR的影響
若在待測樣品中加入已知起始拷貝數(shù)的內(nèi)標(biāo),，則PCR反應(yīng)變?yōu)殡p重PCR,，雙重PCR反應(yīng)中存在兩種模板之間的干擾和競爭，尤其當(dāng)兩種模板的起始拷貝數(shù)相差比較大時,，這種競爭會表現(xiàn)得更為顯著〔7,8〕,。
但由于待測樣品的起始拷貝數(shù)是未知的，所以無法加入合適數(shù)量的已知模板作為內(nèi)標(biāo),。也正是這個原因,，傳統(tǒng)定量方法雖然加入內(nèi)標(biāo),，但仍然只是一種半定量的方法。
美國Texas大學(xué)的科研人員進(jìn)行了外標(biāo)法定量和內(nèi)標(biāo)法定量的方法學(xué)比較,，得出的結(jié)論是：內(nèi)標(biāo)法作為定量或半定量的手段是不可靠的,，而外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方〔9〕,。
Applied Biosystems公司的7700型實(shí)時熒光定量PCR儀是*的熒光定量PCR的金標(biāo)準(zhǔn),，可實(shí)現(xiàn)多色熒光同時檢測，但定量檢測仍然采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法,，而不用內(nèi)標(biāo)進(jìn)行定量,。
綜上所述，利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時熒光定量PCR是迄今為止定量準(zhǔn)確,，重現(xiàn)性的定量方法,，已得到*的*，廣泛用于基因表達(dá)研究,、轉(zhuǎn)基因研究,，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域〔10,11,12,13〕,。
參考文獻(xiàn)
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2. DNA/RNA Real-Time Quantitative PCR-Rev. B Applied Biosystems
3. 定量聚合酶鏈反應(yīng)的研究進(jìn)展與臨床應(yīng)用. 中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志2000, 23(2): 120-121.
4. Anderson KM, Cheung PH, Kell MD. Rapid generation of homologous internal standards and evaluation of data for quantitaion of messenger RNA by competitive polymerase chain reaction. J Pharmacol Toxicol Methods, 1997, 38: 133-140.
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6. 仝文斌,，高巍，費(fèi)然等. 核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的量化酶免疫通用型檢測方法. 中華醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)雜志,，1999, 22: 83-86.
7. Actor JK, Limor JR, Hunter RL. A flexible bioluminescent-quantitive polymerase reaction assay for analysis of competitive PCR amplicons. J Clin Lab Anal, 1999, 13(1): 40-47.
8. Schnell S, Mendoza C. Enzymological considerations for a theoretical description of the quantitative competitive polymerase chain reaction(QC-PCR). J Theor Biol, 1997, 184(4): 433-440.
9. Ke LD, Chen Z, Yung WK. A reliability test of standard-based quantitative PCR: exogenous vs endogenous standards. Mol. Cell Probes, 2000, 14(2): 127-135.
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11. Higgis, J.A., etal. 5’ nuclease PCR assay to detect Yersinia pesits. J Clin Microbiol, 1998, 36: 2284-2288.
12. Bieche I., P.Oondy, etal. Real-time reverse transcription-PCR assay for future nagement of ERBB2-based clinical apolications. Clin.Chem, 1999, 45: 1148-1156.
13. Wang X. X. Li, etal. Application of real-time polymerase chain reaction to quantitate induced expression of interleukin-1 beta mRNA in ischemic brain tolerance. 2000,Neurosci.Res, 59(2): 238-46