| 產(chǎn)品及特點(diǎn) | 扎伊爾埃博拉病毒(Zaire Ebola Virus,ZEBO)是一種RNA病毒,，是一種能引起人類和其他靈長類動(dòng)物產(chǎn)生埃博拉出血熱的烈性傳染病病毒,，其引起的埃博拉出血熱是當(dāng)今世界上致命的病毒性出血熱,，感染者癥狀與同為纖維病毒科的馬爾堡病毒極為相似,，包括惡心、嘔吐,、腹瀉,、膚色改變、全身酸痛,、體內(nèi)出血,、體外出血、發(fā)燒等,。死亡率在50%至90%之間,，致死原因主要為中風(fēng)、心肌梗塞,、低血容量休克或多發(fā)性器官衰竭,，因此快速準(zhǔn)確鑒定對(duì)該病的預(yù)防和檢疫有著重要作用。本產(chǎn)品基于PCR原理開發(fā),。它具有下列特點(diǎn)： - 一站式，用于不需要單獨(dú)準(zhǔn)備每種成分,，包括引物和對(duì)照,。
- 根據(jù)扎伊爾埃博拉病毒的保守基因序列設(shè)計(jì)的引物，具有良好的特異性,。
- 基于染料法qRT-PCR檢測,，靈敏度比常規(guī)RT-PCR高10-100倍，可以達(dá)到至少1000拷貝/反應(yīng)。
- 使用一管式qRT-PCR技術(shù),，RT和PCR兩步在一個(gè)試管內(nèi)完成，不需要中間轉(zhuǎn)移樣品,，降低了操作誤差和可能的污染,。
- 本產(chǎn)品足夠50次30μL體系的RT-PCR，只能用于科研,，不能用于臨床,。
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| 使用方法 | 一,、稀釋陽性對(duì)照（以10E2-10E7這6個(gè)10倍稀釋度為例,。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行）,。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原,。 - 標(biāo)記6個(gè)離心管，分別為7,，6,，5，4,，3,，2。用帶芯槍頭分別加入45 μL 熒光PCR模板稀釋液,，用帶芯槍頭,，下同）。
- 在7號(hào)管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽性對(duì)照(本試劑盒提供),，充分震蕩1分鐘,，得1×10E7拷貝/μL的陽性對(duì)照。放冰上待用,。
- 換槍頭,，在6號(hào)管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘,，得1×10E6拷貝/μL的陽性對(duì)照,。放冰上待用,。
- 換槍頭，在5號(hào)管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得),，充分震蕩1分鐘,，得1×10E5拷貝/μL的陽性對(duì)照。放冰上待用,。重復(fù)上面的操作直到得到6個(gè)稀釋度的陽性對(duì)照,。放冰上待用。
二,、樣品RNA的制備 - 如果有N個(gè)樣品,，必須設(shè)置N+2個(gè)提取，多出的一個(gè)是PC（樣品制備陽性對(duì)照）,，一個(gè)是NC（樣品制備陰性對(duì)照）,。可以用10μL上步制備的陽性對(duì)照梯度稀釋液中的第4號(hào)（濃度為1×10E4拷貝/μL,，10μL相當(dāng)于1萬拷貝）再加上一定量的水作為制備的陽性對(duì)照（加水后其總體積跟樣品一樣,，樣品體積多少取決于所用試劑盒的要求）?？梢?/span>用水作為制備的陰性對(duì)照,。
- 用自選方法純化N+2個(gè)樣品的RNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒RNA提取試劑盒兼容,。本試劑盒免費(fèi)贈(zèng)送20次免RNA提取的天凈沙核酸釋放劑試用裝
三,、設(shè)置RT-PCR反應(yīng)（20μL體系，在樣品制備室進(jìn)行） - 如果做定量分析并且只做1次重復(fù),，則標(biāo)記N+9個(gè)PCR管,，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品，1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照,，6個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線,。如果做定性分析，并且只做1次重復(fù),，則標(biāo)記N+4個(gè)PCR管,，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品，1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照（用水做模板）,，1個(gè)用于PCR陽性對(duì)照（用第4號(hào)陽性對(duì)照稀釋液做模板）,。下面只描述定量分析的步驟，定性分析只是把6個(gè)標(biāo)曲反應(yīng)縮減成1個(gè),，其余不變,。
- 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對(duì)照,，陽性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子后后加）：
成分 | N+2個(gè)制備所得樣品 | RT-PCR陰性對(duì)照 | RT-PCR陽性 對(duì)照（2-7管） | 2×qRT-PCR 緩沖液 | 10μL | 10μL | 各10μL | 口蹄疫病毒RT-PCR 引物混合物 | 2μL | 2μL | 各2μL | 50×ROX (見注) | 0.4μL | 0.4μL | 各0.4μL | 樣品制備所得RNA模板（來于第8步） | 5.6μL | 不加 | 不加 | 稀釋所得6個(gè)陽性對(duì)照（來于第6步） | 不加 | 不加 | 各5.6μL（2號(hào)樣到2號(hào)管,，3號(hào)樣到3號(hào)管…） | 10×qRT-PCR 酶混合液 | 2μL | 2μL | 2μL |
注:需使用ROX染料I的機(jī)型：ABI Prism7000、7300,、7700,、7900HT、Step-One,、Step-One Plus,。 需使用ROX染料II的機(jī)型：：ABI Prism 7500、7500Fast,、MJ Research的Chromo4,、Opticon（II）Corbett Rotor Gene 3000。 不需要使用ROX的機(jī)型：Thermal Cycle Dice Real Time System,， LightCycler,、Smart Cycler System、Agilent Mx3000P,、RotorGene 3000,、RotorGene 6000。 - 上機(jī)后按下面參數(shù)進(jìn)行RT-PCR（參數(shù)可能會(huì)因儀器不同而需優(yōu)化）,。
過程 | 溫度 | 時(shí)間 | RT（逆轉(zhuǎn)錄） | 50℃ | 15-30分鐘 | 預(yù)變性 | 94℃ | 2分鐘 | RT - PCR反應(yīng) （30個(gè)循環(huán)） | 95℃ | 15 秒 | 60℃ | 15 秒（采集FAM通道的熒光信號(hào)） | 72℃ | 15 秒 | 按儀器預(yù)設(shè)程序進(jìn)行溶解曲線分析 |
- 如果把本試劑盒用于定量檢測,，則以陽性對(duì)照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸,，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,。再以待測樣品的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品RNA濃度的log值，再推算出其濃度,。
- 如果把本試劑盒用于定性檢測,，只判斷陽性或陰性，則陰性對(duì)照Ct必須大于或等于40,。陽性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長,，有典型擴(kuò)增曲線，Ct值應(yīng)該小于或等于30,。對(duì)待測樣品,，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于35則為陽性,。如果在35-40之間,，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的Ct值如果大于或等于40則為陰性,，如果小于40,，則為陽性。
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