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小鼠線粒體 DNA 探針法熒光定量 PCR 試劑盒
閱讀：543 發(fā)布時間：2019-9-9產品及特點 線粒體是真核生物產生能量的重要細胞器,，它具有自身的基因組，線粒體 DNA 和
細胞核 DNA 共同決定真核生物的表現型,，因此研究線粒體 DNA 具有重要的意義,。
本試劑盒基于熒光定量 PCR 原理開發(fā)，可用于定量分析小鼠線粒體 DNA,。它具有下
列特點：
1. 即開即用,，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。
2. 根據小鼠線粒體 DNA 保守區(qū)域設計引物和探針,，能專一性地檢測出樣品中的小鼠
線粒體 DNA 成分,，但不能檢測其他非小鼠線粒體 DNA 成分。
3. 提供陽性對照,，便于區(qū)分假陰性樣品,。
4. 一管式閉管操作，降低了交叉污染,。
5. 快速,，整個檢測過程（按一個樣品計）所需時間僅為 2.0 小時。
6. 本只能用于科研,，足夠 50 次 20uL 體系的探針法熒光定量 PCR,。
規(guī)格及成分 成分 編號 十孔盒包裝
2×Probe qPCR MagicMix 190303 0.5 mL（本色蓋）
熒光 PCR 模板稀釋液 180701 1 mL（黃蓋）
小鼠線粒體 DNA 探針法 qPCR 引物混合
液
15-141yw 100 uL（白蓋）
小鼠線粒體 DNA qPCR 探針 15-141pb 50 uL（棕色管）
小鼠線粒體 DNA 探針法 qPCR 陽性對照
（1×10E8 拷貝/uL）
60908-
141pc
50 uL（黃蓋）
天凈沙核酸釋放劑試用裝 61202 20 次（1mL，綠蓋）
使用手冊 15-141sc 1 份
運輸及保存 低溫運輸,，-20℃保存,，有效期一年。使用本試劑盒提供的陽性對照時,，由于其濃度較
高,，一定要注意不要污染其他試劑和成分。在專門的區(qū)域操作,。
自備試劑 DNA 模板
使用方法 一,、稀釋標準曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）。由于標
準品濃度非常高,，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行,，千萬不能污染樣品或本
試劑盒的其他成分）。
1. 標記 6 個離心管,，分別為 7,，6，5,，4,，3,，2,。
2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液,，用帶芯槍頭，下同）,。
3. 在 7 號管中加入 5 μL 陽性對照（濃度為 1×10E8 拷貝/μL,，試劑盒提供)，充分
震蕩 1 分鐘,，得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品,。放冰上待用。
4. 換槍頭,，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),，
充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品,。放冰上待用,。
5. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),，
充分震蕩 1 分鐘,，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用,。
6. 重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品,。放冰上待用。
二,、樣品 DNA 的制備
7. 用自選方法純化樣品的 DNA,，本產品跟市場上絕大多數核酸純化產品兼容。
8. 如果有 N 個樣品,，則需要進行 N+2 個樣品提取,，多出的一個用作樣品制備陽性對
照管、另一個用作樣品制備陰性對照管,。如果用本試劑盒自帶的天凈沙核酸釋放劑
試用裝
三,、設置 qPCR 反應（20μL 體系，在樣品制備室進行）
9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復,，則標記 N+9 個 PCR 管,，其中 N+2 個用于上
步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板）,，6 個用于標準曲
線,。如果做定性分析，并且只做 1 次重復,，則標記 N+4 個 PCR 管,，其中 N+2 個
用于上步得到的 N+2 個樣品,，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），1 個用于
PCR 陽性對照（用步稀釋得到的標準曲線系列稀釋液的第 4 號做模板）,。下
面只以定量分析為例描述操作步驟,。
10. 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復）：
成分
樣品管
N+2 個
PCR 陰性
對照管
標準曲線
樣品管（2-7 管）
2×Probe qPCR MagicMix 10 μL 10 μL 各 10 μL
小鼠線粒體 DNA 探針法 qPCR
探針 1 μL 1 μL 各 1 μL
小鼠線粒體 DNA 探針法 qPCR
引物混合液 2 μL 2 μL 各 2 μL
N+2 個待測樣品 DNA 模板 7 μL 不加 不加
超純水 不加 7 μL 不加
第 7 步所得標準曲線樣品稀釋液
（2-7 號）
不加 不加
各 7μL（2 號樣到 2
號管，3 號樣到 3 號
管…）
四,、qPCR 反應參數
過程 溫度 時間
預熱 50℃ 2 min
預變性 95℃ 10 min
PCR 反應
（50 個循環(huán)）
95℃ 15sec
60℃ 1min（采集 FAM 通道的熒光信號）
五,、數據處理
11. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸,，以 Ct 值為縱
軸,，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 DNA 濃度的
log 值,，再推算出其濃度,。
12. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性,，則陰性對照 Ct 必須大于或等
于 40,。陽性對照必須有熒光對數增長，有典型擴增曲線,，Ct 值應該小于或等于
30,。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性,，如果小于或等于 35 則為
陽性,。如果在 35-40 之間，則重復一次,。重復實驗的 Ct 值如果大于或等于 40 則
為陰性,，如果小于 40，則為陽性,。
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