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新加坡石斑魚虹彩病毒染料法熒光定量PCR試劑盒
閱讀：279 發(fā)布時間：2019-9-6
產(chǎn)品及特點 | 新加坡石斑魚虹彩病毒(Singapore Grouper Iridovirus,，SGIV)感染后主要是會造成造血織組壞死,，傳染方式主要是以水平感染為主，該病的外觀臨床癥狀一般包括：體表無明顯損傷,，嗜睡,，游泳異常；貧血癥狀明顯，血液稀薄,、色淡,，凝固性差，鰓外觀呈暗灰色,；腎臟失血,，呈灰白色等。但病魚的臨床癥狀也存在一定的差異,，該病毒的感染對養(yǎng)魚業(yè)造成嚴重損害,，因此新加坡石斑魚虹彩病毒的快速準確鑒定對該病的預(yù)防和檢疫有著重要作用，為此本公司開發(fā)了簡單快捷的新加坡石斑魚虹彩病毒染料法熒光定量PCR檢測試劑盒,，它具有下列特點： 1. 即開即用,，用戶只需要提供病毒樣品。 2. 根據(jù)新加坡石斑魚虹彩病毒保守序列設(shè)計的專一性引物,，與相關(guān)病毒無交叉反應(yīng),。 3. 靈敏度可以達到幾百拷貝/反應(yīng)。 4. 一管式熒光定量PCR檢測,，避免后續(xù)污染,。 5. 本試劑盒足夠50次20μL反應(yīng)體系的熒光定量PCR。 6. 本產(chǎn)品只適用于科研,，不能用于臨床診斷,。 |
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規(guī)格及成分 |
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運輸及保存 | 低溫運輸、-20℃保存,，有效期一年,。 |
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自備試劑 | DNA模板、10×ROX（根據(jù)機型決定,，具體見使用方法）,。 |
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使用方法 | 一、稀釋PCR陽性對照（以10E2-10E7拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例） 1. 注意：由于標準品濃度非常高,，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行,，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原,，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照,，只提供可以直接使用的DNA片段作為陽性對照。 2. 標記6個離心管,，分別為7,，6，5,，4,，3,，2。 3. 用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR模板稀釋液（用帶芯槍頭,，下同）,。 4. 在7號管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽性對照，充分震蕩1分鐘,，得1×10E7拷貝/μL的陽性對照,。放冰上待用。 5. 換槍頭,，在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的陽性對照,。放冰上待用,。 6. 換槍頭，在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL的陽性對照到5號管中,，充分震蕩1分鐘,，得1×10E5拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用,。 7. 重復(fù)上面的操作直到得到6個稀釋度的陽性對照,。放冰上待用。 二,、樣品DNA的制備 8. 如果有N個樣品,，必須設(shè)置N+2個提取，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照）,，一個是NC（樣品制備陰性對照）,。可以用10μL上步制備的PCR陽性對照的第4號（濃度為1×10E4 拷貝/μL,，10μL相當于1萬拷貝）或第5號（濃度為1×10E5 拷貝/μL,，10μL相當于10萬拷貝）再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC,。另外用水作為NC,。如果每次制備需要200μL樣品，則PC和NC的體積也必須是200μL,。 9. 用自選方法純化樣品的DNA,，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒DNA提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的一管式病毒DNAout或其升級版柱式病毒DNAout,。本試劑盒免費贈送15次一管式病毒DNAout 三,、設(shè)置qPCR反應(yīng)（20 μL體系，在樣品制備室進行） 10. 如果只做1次重復(fù),，則標記N+9個PCR管,，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品,，1個用于PCR陰性對照,，6個用于PCR陽性對照,。如果做2-3次重復(fù)，則反應(yīng)設(shè)置數(shù)量相應(yīng)增加2或3倍,。 11. 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù),。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后后加）：
注:僅ABI7500,、7700和7900儀器需要使用ROX作為對照，其他熒光PCR儀器（如iCycler IQ,、MJ Option,、MJ Chromo4、MX3000,、MX4000,、RotorGene 3000、RotorGene 6000和LightCycler480）不需要使用ROX,，則用水替代,。 12. 蓋上蓋子后上機，按下面參數(shù)進行PCR（具體PCR參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行優(yōu)化）,。
13. 數(shù)據(jù)采集 具體操作按所用儀器推薦的流程進行,。本產(chǎn)品中所含的熒光染料在不結(jié)合DNA時，大吸收光譜在471 nm,，結(jié)合DNA時的大吸收光譜在500 nm,，大發(fā)射光譜在530 nm。信號采集可以設(shè)置在復(fù)性或延伸步驟,。 四,、數(shù)據(jù)處理 14. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log值為橫軸,，以Ct值為縱軸,，繪制標準曲線。再以待測樣品的Ct值從標準曲線上推算出樣品DNA濃度的log值,，再推算出其濃度,。 15. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性,，則陰性對照Ct必須大于或等于40,。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲線,，Ct值應(yīng)該小于或等于30,。對待測樣品,，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于35則為陽性,。如果在35-40之間,，則重復(fù)一次。重復(fù)實驗的Ct值如果大于或等于40則為陰性,，如果小于40,，則為陽性。 |
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關(guān)聯(lián)產(chǎn)品 | 新加坡石斑魚虹彩病毒LAMP恒溫檢測試劑盒 |
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