產(chǎn)品及特點 | 超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌(ESBL-Escherichia coli)是一種在醫(yī)院內(nèi)感染的常見機會致病菌，各臨床科室以及標本類型中均有檢出,，科室分布以普外科為主，標本類型以傷口分泌物標本為主,，常引起外殼感染性疾病,，該細菌對多種抗生素有較強的耐藥性，所以醫(yī)院要加強對該細菌的耐藥性的檢測與監(jiān)控,，積極做好細菌的培養(yǎng)和藥物敏感性試驗,，規(guī)范合理使用抗生素，以控制耐藥菌的出現(xiàn)和流行,，因此快速檢測超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌具有重要意義,。熒光定量PCR是檢測傳染性疾病的主流技術(shù),，本產(chǎn)品就是以染料法熒光定量PCR技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌的試劑盒，它具有下列特點： - 即開即用,，用戶只需要提供樣品DNA模板,。
- 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，靈敏性高,。
- 提供陽性對照,，便于區(qū)分假陰性樣品。
- 特異性高,，引物是根據(jù)人超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌高度保守的VP1區(qū)設(shè)計,，不會跟其他微生物的DNA發(fā)生交叉反應(yīng)。
- 本產(chǎn)品足夠50次20μL體系的探針法熒光定量PCR反應(yīng),。
- 本產(chǎn)品只能用于科研,。
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使用方法 | 一,、稀釋標準曲線樣品（以10E2-10E7拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例）,。由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行,，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）,。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照,，只提供無傳染性的DNA片段作為陽性對照,。 - 標記6個離心管,，分別為7,，6，5,，4,，3，2,。
- 用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR模板稀釋液,，用帶芯槍頭，下同）,。
- 在7號管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供),，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的標準曲線樣品,。放冰上待用,。
- 換槍頭,，在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘,，得1×10E6拷貝/μL的標準曲線樣品,。放冰上待用。
- 換槍頭,，在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的標準曲線樣品,。放冰上待用,。
- 重復(fù)上面的操作直到得到6個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用,。
二,、樣品DNA的制備 - 如果有N個樣品，設(shè)置N+2個提取,，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照）,，一個是NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?0μL陽性對照的10000倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣,，以此作為PC。另外用水作為NC,。
- 用自選方法純化樣品的DNA,，本試劑盒跟市場上大多數(shù)細菌DNA提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的細菌DNAout或柱式細菌DNAout,。本試劑盒免費贈送50次免DNA提取的天凈沙DNA釋放劑,，本產(chǎn)品的裂解液可以直接作為PCR模板，省略了DNA提取步驟,。
三,、Probe qPCR反應(yīng)（20μL體系，在樣品制備室進行） - 如果只做1次重復(fù),，則標記N+9個PCR管,，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照,，6個用于標準曲線樣品,。
- 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照,，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后后加）：
成分 | 樣品管 N+2個 | PCR陰性對照管 | 標準曲線 樣品管（2-7管） | 2×Probe qPCR MagicMix（本色蓋） | 10 μL | 10 μL | 各10 μL | 超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌 qPCR探針（綠蓋） | 2 μL | 2 μL | 各2 μL | 超廣譜β-內(nèi)酰胺酶大腸埃希菌 PCR引物混合液（白蓋） | 2 μL | 2 μL | 各2 μL | 待測樣品DNA模板 | 6 μL | 不加 | 不加 | 第7步所得標準曲線樣品稀釋液（2-7號） | 不加 | 不加 | 各6μL（2號樣到2號管,，3號樣到3號管…） |
過程 | 溫度 | 時間 | 預(yù)變性 | 94℃ | 5 min | PCR反應(yīng) （40個循環(huán)） | 94℃ | 0.5 min | 50℃ | 0.5 min（采集FAM通道的熒光信號） | 72℃ | 0.5 min | 后延伸 | 72℃ | |
五,、數(shù)據(jù)處理 - 以陽性對照濃度的log值為橫軸,，以Ct值為縱軸,，繪制標準曲線。再以待測樣品的Ct值從標準曲線上推算出樣品DNA濃度的log值,，再推算出其濃度,。
六、電泳檢測 - 如果有必要電泳確認,，可取10-20μL PCR產(chǎn)物直接在瓊脂糖凝膠上電泳產(chǎn)物的大小為400 bp,。但電泳非常容易污染實驗環(huán)境，建議不輕易采納,。
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