用途 禽流感病毒 N9 亞型（AIV-N9）反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT－PCR）檢測試劑盒,，用于檢測 禽組織、分泌物,、排泄物及尿囊液中的 AIV-N9,，適用于 AIV-N9 的診斷、檢測和流行病學(xué)調(diào)查,。 原理 利用離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜提取 RNA,，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以 RNA 為模板，以引物為起點

合成與 RNA 模板互補(bǔ)的 cDNA 鏈,。在 TaqDNA 聚合酶的作用下,，經(jīng)高溫變性、低溫退火,、中溫延 伸的循環(huán),，使特異 DNA 段的拷貝數(shù)放大一倍。經(jīng)過 35 次循環(huán),，終使擴(kuò)增 DNA 段放大了數(shù) 百萬倍,。將擴(kuò)增 DNA 段進(jìn)行電泳，經(jīng)染色后,，在紫外燈照射下,，肉眼可見到 DNA 段的擴(kuò)增帶。

試劑盒組成

 

名稱	10 頭份	50 頭份	貯藏條件
0.2 mL 薄壁 PCR 管	15 個	60 個	室溫（A 盒）
吸附柱和收集管	10  套	50 套
裂解液	6 mL	30 mL
洗液	12 mL	60 mL
洗脫液	1 mL	10 mL
礦物油	300 µL	1.2 mL
50 倍 TAE 電泳緩沖液（50 倍稀釋后使用）	20 mL	100 mL
染色液	20 µL	50 µL
陰性對照	350 µL	1 mL	-20 ℃（B 盒）
陽性對照	350 µL	1 mL
RT-PCR 反應(yīng)液	200 µL	1 mL
X 液	5 µL	10 µL
酶混合液	15 µL	65 µL

 

保存期 本產(chǎn)品有效期為 6 個月,。

需自備的物品

1．儀器：分析天平,、離心機(jī)、PCR 擴(kuò)增儀,、電泳儀,、電泳槽、紫外凝膠成像儀（或紫外分析儀）,、 微波爐,、組織研磨器、-20 ℃冰箱,、可調(diào)移液器（2 µL,、20 µL、200 µL,、1000 µL）,。 2．耗材：眼科剪、眼科鑷,、稱量紙,、20 mL 一次性注射器,、生理鹽水,、瓊脂糖,、500 mL 量筒、500 mL 錐形瓶、經(jīng)焦碳酸二乙酯（DEPC）水處理的滅菌 1.5mL 離心管和吸頭（10 µL,、200 µL,、1000 µL）、 滅菌雙蒸水,。

注意事項

1．所有接觸病料的物品均應(yīng)合理處置，以免污染實驗室,。

2．PCR  整個試驗分配液區(qū),、模板提取區(qū)、擴(kuò)增區(qū),、電泳區(qū),。流程順序為配液區(qū)→模板提取區(qū)→擴(kuò) 增區(qū)→電泳區(qū)。嚴(yán)禁器材和試劑倒流,。

3．所有試劑應(yīng)在規(guī)定的溫度儲存。-20℃保存的各試劑管使用前應(yīng)*融化,，8000 rpm 離心 15 s， 使液體全部沉于管底,，放于冰盒中,，吸取液體時移液器吸頭盡量在液體表面層吸取，使用后立 即放回-20 ℃,。

4．在 RNA 提取過程中,，避免 RNA 酶污染，盡量縮短操作時間,。

5． 染色液低毒,，操作時應(yīng)戴上手套，避光保存,，較長時間不使用請存放于 4℃,，以免揮發(fā)變干。

 

染色液和上樣緩沖液使用前也請離心使液體沉于管底,。

6．注意防止試劑盒組分受污染,。不要使用超過有效期限的試劑,，試劑盒之間的成分不要混用,。

7．嚴(yán)格遵守操作說明可以獲得的結(jié)果。操作過程中移液,、定時等全部過程必須,。

8．反復(fù)凍融試劑將減低檢測靈敏度，建議在 3 次內(nèi)用完,，請嚴(yán)格按試劑盒說明書操作,。

樣品制備

1 樣品采集：病死或撲殺禽，取喉氣管,、肌肉和肺等組織,；待檢活禽，用棉拭子取呼吸道分泌物或 排泄物,，置于 50%甘油生理鹽水中,。2～8 ℃保存，送實驗室檢測,。（要求送檢病料新鮮,，嚴(yán)禁反復(fù) 凍融。）

2  樣品處理：每份樣品分別處理,。

2.1 組織樣品處理：每份組織分別從三個不同的位置稱取樣品約 1g,，用手術(shù)剪剪碎混勻后取 0.02 g 于研磨器中研磨,，加入 1.5 mL 生理鹽水繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5 mL 滅菌離心管中,，8000 rpm 離心 2 min,，取上清液 100 µL 于 1.5 mL 滅菌離心管中。

2.2  陽性對照處理：取陽性對照 100 µL,，置 1.5 mL 滅菌離心管中,。

2.3  陰性對照處理：取陰性對照 100 µL，置 1.5 mL 滅菌離心管中,。

操作步驟

1 病毒 RNA 的提取

1.1 取已處理的樣品,、陰性對照和陽性對照，分別加入裂解液 600 µL,，充分顛倒混勻,，室溫靜置 3～

5 min。

1.2  將液體吸入吸附柱中（吸附柱要套上收集管,，吸取液體時盡量不要吸到懸浮雜質(zhì),，以免離心時 堵塞吸附柱），13000 rpm 離心 30 s,。

1.3  棄去收集管中液體,，加入 600 µL 洗液，13000 rpm 離心 30 s,。

1.4 重復(fù)步驟 1.3,。

1.5 棄去收集管中液體，13000 rpm 空柱離心 2 min,，以除去殘留的洗滌液,。

1.6  將吸附柱移入新的 1.5 mL 離心管中，向柱中央加入洗脫液 50 µL,，室溫靜置 1 min,，13000 rpm

離心 30 s，離心管中液體即為模板 RNA,。

2 RT-PCR 擴(kuò)增

每份總體積 20 µL,，含 16.8 µL RT-PCR 反應(yīng)液（用前混勻），1.2 µL 酶混合液,，2 µL 模板 RNA,。 例如：n 份樣品，配制 n+1 份,，16.8×（n+1）RT-PCR 反應(yīng)液,，再加入 1.2×（n+1）酶混合液，

混勻后取 18 µL 分裝成 n 份,，分別加入 2 µL 模板 RNA（陽性對照管加入 1 µL 陽性對照 RNA 和 1 µL X 液）,，加入礦物油 20 µL 覆蓋（有熱蓋的 PCR 擴(kuò)增儀不用加礦物油）,，作好標(biāo)記。

在 PCR 擴(kuò)增儀上進(jìn)行以下程序：42 ℃ 45 min,，95 ℃ 3 min,；循環(huán) 95 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s,，72 ℃

30 s,，共 35 次；再 72 ℃延伸 7min,。

3 電泳

稱 3 g 瓊脂糖放于 500 mL 錐形瓶中,，加入 50 倍稀釋的 TAE 電泳緩沖液 200 mL（取 4 mL 50 倍 TAE 電泳緩沖液，用雙蒸水稀釋至 200 mL）,，于微波爐中熔解,，再加入 10 µL 染色液混勻。在電泳 槽內(nèi)放好梳子,，倒入瓊脂糖凝膠,，待凝固后將 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物 10 µL，點樣于瓊脂糖凝膠孔中,，以 110～ 120V 電壓于 50 倍稀釋的 TAE 電泳緩沖液中電泳,，紫外燈下觀察結(jié)果。

結(jié)果判定 陽性對照出現(xiàn) 377bp 擴(kuò)增帶,、陰性對照無帶出現(xiàn)（引物帶除外）時,，實驗結(jié)果成立。 被檢樣品出現(xiàn) 377bp 擴(kuò)增帶為禽流感病毒 N9 亞型陽性,，否則為陰性,。