產(chǎn)品及特點(diǎn) | 本試劑盒可用于檢測食品或其他材料中是否有鹿的成分?，F(xiàn)代食品加工工藝極大改變了食材原有的味道,、氣味、色澤,、紋理和質(zhì)地等特性,，因此傳統(tǒng)的感官鑒別技術(shù)已經(jīng)無法對食材的真?zhèn)芜M(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定。同時部分食材還有致敏性,，因此基于基因檢測的快速靈敏的食材來源檢測技術(shù)將對食品監(jiān)管和安全提供重要的保障,。本產(chǎn)品就是為滿足這一需求根據(jù)PCR原理開發(fā)的產(chǎn)品，它具有下列特點(diǎn)： - 即開即用,，用戶只需要提供樣品DNA,。
- 根據(jù)鹿保守區(qū)域設(shè)計引物，能專一性地檢測出樣品中的鹿成分,，包括馬鹿,、梅花鹿、坡鹿,、水鹿和白唇鹿,，但不能檢測其他動物成分。
- 熒光定量PCR檢測,，既可以定量,，也可以定性，比常規(guī)PCR更加靈敏和靈活,。
- 快速,，整個檢測過程（按一個樣品計）所需時間僅為2.0小時。
- 一管式閉管操作,，降低了交叉污染,。
- 提供陽性標(biāo)準(zhǔn)品，便于分析實驗結(jié)果。
- 對混合樣品中鹿成分的檢測下限為0.1%,，對樣品中鹿成分的核酸檢測下限為 1.0ng/µL,。
- 本只能用于科研，足夠50次20μL體系的熒光定量PCR,。
- 本產(chǎn)品參考國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T21106-2007制備,。
| |
使用方法 | 一,、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以10E2-10E7拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例）。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高,，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行,，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原,，本產(chǎn)品不提供動物樣品做陽性對照,，只提供無傳染性的DNA片段作為陽性對照。 - 標(biāo)記6個離心管,，分別為7,，6，5,，4,，3,，2,。
- 用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR模板稀釋液，用帶芯槍頭,，下同）,。
- 在7號管中加入5 μL陽性對照（濃度為1×10E8拷貝/μL，試劑盒提供),，充分震蕩1分鐘,，得1×10E7拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用,。
- 換槍頭,，在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用,。
- 換槍頭，在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),，充分震蕩1分鐘,，得1×10E5拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用,。
- 重復(fù)上面的操作直到得到6個稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用。
二,、樣品DNA的制備 - 用自選方法純化樣品的DNA,，本產(chǎn)品跟市場上絕大多數(shù)核酸純化產(chǎn)品兼容。
- 如果有N個樣品,，則需要進(jìn)行N+2個樣品提取,，多出的一個用作樣品制備陽性對照管、另一個用作樣品制備陰性對照管,。如果用本試劑盒自帶的天凈沙核酸釋放劑試用裝,，則登陸公司網(wǎng)站輸入產(chǎn)品名稱天凈沙核酸釋放劑或產(chǎn)品編號61202下載。
三,、設(shè)置qPCR反應(yīng)（20μL體系,，在樣品制備室進(jìn)行） - 如果做定量分析并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+9個PCR管,，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品,，1個用于PCR陰性對照，6個用于標(biāo)準(zhǔn)曲線,。如果做定性分析,，并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+4個PCR管,，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品,，1個用于PCR陰性對照（用水做模板），1個用于PCR陽性對照（用第4號陽性對照稀釋液,，濃度為10000拷貝/μL）,。下面只描述定量分析的步驟，定性分析只是把6個標(biāo)曲反應(yīng)縮減成1個,，其余不變,。
- 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照,，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后后加）：
成分 | 樣品管 N+2個 | PCR陰性對照管 | 標(biāo)準(zhǔn)曲線 樣品管（2-7管） | 2×qPCR MagicMix | 各10 μL | 10 μL | 各10 μL | 鹿源型成分染料法PCR 引物混合液 | 各2 μL | 2 μL | 各2 μL | 自備10×ROX (見注) | 各2 μL | 2 μL | 各2 μL | N+2個制備的DNA模板 | 各6 μL | 不加 | 不加 | 超純水 | 不加 | 6 μL | 不加 | 第7步所得標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品稀釋液 （2-7號） | 不加 | 不加 | 各6μL（2號樣到2號管,，3號樣到3號管…） |
注:僅ABI7500、7700和7900儀器需要使用ROX作為對照，其他熒光PCR儀器（如iCycler IQ,、MJ Option,、MJ Chromo4、MX3000,、MX4000,、RotorGene 3000、RotorGene 6000和LightCycler480）不需要使用ROX,，則用水替代,。 - 蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行qPCR（具體PCR參數(shù)可以根據(jù)qPCR儀器的不同而自行優(yōu)化）,。
四,、qPCR反應(yīng)參數(shù) 過程 | 溫度 | 時間 | 預(yù)變性 | 95℃ | 3 min | PCR反應(yīng) （40個循環(huán)） | 95℃ | 0.5 min | 60℃ | 1 min（采集FAM通道的熒光信號） |
五、數(shù)據(jù)處理 - 如果把本試劑盒用于定量檢測,，則以陽性對照濃度的log值為橫軸,，以Ct值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,。再以待測樣品的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品DNA濃度的log值,，再推算出其濃度。
- 如果把本試劑盒用于定性檢測,，只判斷陽性或陰性,，則陰性對照Ct必須大于或等于40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長,，有典型擴(kuò)增曲線,，Ct值應(yīng)該小于或等于30。對待測樣品,，如果其Ct大于或等于40則為陰性,，如果小于或等于35則為陽性。如果在35-40之間,，則重復(fù)一次,。重復(fù)實驗的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40,，則為陽性,。
| |
化工儀器網(wǎng)