產(chǎn)品及特點(diǎn) | 人皰疹病毒8型（Human Herpesvirus-8,，HHV-8) 會(huì)引起人類的原發(fā)和繼發(fā)感染，原發(fā)感染在兒童中多見,，水痘的出疹突發(fā),，常出現(xiàn)紅色皮疹或斑疹，繼續(xù)發(fā)展為成串水皰、膿皰,，后結(jié)痂,。病情一般較輕，但偶可并發(fā)間質(zhì)性肺炎和感染后腦炎,。該病毒對人體健康造成嚴(yán)重?fù)p害,，因此快速檢測人皰疹病毒8型具有重要意義。為此本公司開發(fā)了簡單快捷的人皰疹病毒8型染料法熒光定量PCR檢測試劑盒,，它具有下列特點(diǎn)： - 即開即用,，用戶只需要提供病毒樣品。
- 根據(jù)人皰疹病毒8型保守序列設(shè)計(jì)的專一性引物,，與相關(guān)病毒無交叉反應(yīng),。
- 靈敏度可以達(dá)到幾百拷貝/反應(yīng)。
- 一管式熒光定量PCR檢測,，避免后續(xù)污染,。
- 本試劑盒足夠50次20μL反應(yīng)體系的熒光定量PCR。
- 本產(chǎn)品只適用于科研,，不能用于臨床診斷,。
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使用方法 | 一,、稀釋PCR陽性對照（以10E2-10E7拷貝/μL這6個(gè)10倍稀釋度為例） - 注意：由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高,，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）,。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原,，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供可以直接使用的DNA片段作為陽性對照,。
- 標(biāo)記6個(gè)離心管,，分別為7，6,，5,，4，3,，2,。
- 用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR模板稀釋液（用帶芯槍頭,，下同）。
- 在7號(hào)管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽性對照,，充分震蕩1分鐘,，得1×10E7拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用,。
- 換槍頭,，在6號(hào)管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘,，得1×10E6拷貝/μL的陽性對照,。放冰上待用,。
- 換槍頭,，在5號(hào)管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL的陽性對照到5號(hào)管中，充分震蕩1分鐘,，得1×10E5拷貝/μL的陽性對照,。放冰上待用。
- 重復(fù)上面的操作直到得到6個(gè)稀釋度的陽性對照,。放冰上待用,。
二、樣品DNA的制備 - 如果有N個(gè)樣品,，必須設(shè)置N+2個(gè)提取,，多出的一個(gè)是PC（樣品制備陽性對照），一個(gè)是NC（樣品制備陰性對照）,?？梢杂?0μL上步制備的PCR陽性對照的第4號(hào)（濃度為1×10E4 拷貝/μL，10μL相當(dāng)于1萬拷貝）或第5號(hào)（濃度為1×10E5 拷貝/μL,，10μL相當(dāng)于10萬拷貝）再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣,，以此作為PC。另外用水作為NC,。如果每次制備需要200μL樣品,，則PC和NC的體積也必須是200μL。
- 用自選方法純化樣品的DNA,，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒DNA提取試劑盒兼容,。也可以選購本公司的一管式病毒DNAout或其升級(jí)版柱式病毒DNAout。本試劑盒免費(fèi)贈(zèng)送20次免核酸提取的天凈沙核酸釋放劑,，其使用手冊可從
三,、設(shè)置qPCR反應(yīng)（20 μL體系，在樣品制備室進(jìn)行） - 如果做定量分析并且只做1次重復(fù),，則標(biāo)記N+9個(gè)PCR管,，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品,，1個(gè)用于PCR陰性對照，6個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線,。如果做定性分析,，并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+4個(gè)PCR管,，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品,，1個(gè)用于PCR陰性對照（用水做模板），1個(gè)用于PCR陽性對照（用第4號(hào)陽性對照稀釋液,，濃度為10000拷貝/μL）,。下面只描述定量分析的步驟，定性分析只是把6個(gè)標(biāo)曲反應(yīng)縮減成1個(gè),，其余不變,。
- 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照,，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好后后加）：
成分 | 樣品管 N+2個(gè) | PCR陰性對照管 | PCR陽性 對照管（2-7管） | 2×qPCR MagicMix | 10 μL | 10 μL | 各10 μL | 人皰疹病毒8型染料法qPCR引物混合液 | 2 μL | 2 μL | 各2 μL | 自備10×ROX (見注) | 2 μL | 2 μL | 各2 μL | N+2待測樣品DNA模板 | 6 μL | 不加 | 不加 | 第7步所得PCR陽性對照 稀釋液（2-7號(hào)） | 不加 | 不加 | 各6μL（2號(hào)樣到2號(hào)管,，3號(hào)樣到3號(hào)管…） |
注:僅ABI7500、7700和7900儀器需要使用ROX作為對照,，其他熒光PCR儀器（如iCycler IQ,、MJ Option、MJ Chromo4,、MX3000,、MX4000、RotorGene 3000,、RotorGene 6000和LightCycler480）不需要使用ROX,，則用水替代。 - 蓋上蓋子后上機(jī),，按下面參數(shù)進(jìn)行PCR（具體PCR參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行優(yōu)化）,。
過程 | 溫度 | 時(shí)間 | 預(yù)變性 | 95℃ | 5分鐘 | PCR反應(yīng) （40個(gè)循環(huán)） | 95℃ | 15 秒 | 60℃ | 60 秒（采集FAM通道的熒光信號(hào)） |
具體操作按所用儀器推薦的流程進(jìn)行。本產(chǎn)品中所含的熒光染料在不結(jié)合DNA時(shí),，大吸收光譜在471 nm,，結(jié)合DNA時(shí)的大吸收光譜在500 nm，大發(fā)射光譜在530 nm,。信號(hào)采集可以設(shè)置在復(fù)性或延伸步驟,。 - 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log值為橫軸,，以Ct值為縱軸,，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品DNA濃度的log值,，再推算出其濃度,。
- 如果把本試劑盒用于定性檢測,，只判斷陽性或陰性，則陰性對照Ct必須大于或等于40,。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長,，有典型擴(kuò)增曲線，Ct值應(yīng)該小于或等于30,。對待測樣品,，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于35則為陽性,。如果在35-40之間,，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的Ct值如果大于或等于40則為陰性,，如果小于40,，則為陽性。
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