產(chǎn)品及特點(diǎn) | 藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)（Giardia lamblia）主要寄生人體小腸,、膽囊主要在十二指腸，可引起腹痛、腹瀉和吸收不良等癥狀，導(dǎo)致賈第蟲(chóng)病,，為人體腸道感染的常見(jiàn)寄生蟲(chóng)之一。藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)分布于世界各地,。由于旅游事業(yè)的發(fā)展,，在旅游者中發(fā)病率較高，故又稱旅游者腹瀉,，已引起各國(guó)的重視,。藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)感染的患者，以無(wú)癥狀帶蟲(chóng)者居多,，潛伏期多在兩周左右,，甚至可達(dá)數(shù)月不等,，臨床癥狀視病變部位而異,，其表面多種多樣，癥狀輕重也有不同,，因此快速檢測(cè)具有重要意義,。熒光定量PCR是檢測(cè)傳染性疾病的主流技術(shù)，本產(chǎn)品就是以探針法熒光定量PCR技術(shù)為基礎(chǔ)開(kāi)發(fā)的專門檢測(cè)藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)的試劑盒,，它具有下列特點(diǎn)： - 即開(kāi)即用,，用戶只需要提供樣品DNA模板,。
- 引物和探針經(jīng)過(guò)優(yōu)化，靈敏性高,。
- 提供陽(yáng)性對(duì)照,，便于區(qū)分假陰性樣品。
- 特異性高,，引物是根據(jù)人藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)高度保守區(qū)設(shè)計(jì),，不會(huì)跟其他微生物的DNA發(fā)生交叉反應(yīng)。
- 本產(chǎn)品足夠50次20μL體系的探針?lè)晒舛縋CR反應(yīng),。
- 本產(chǎn)品既可用于定性,，也可用于定量。
- 本產(chǎn)品只能用于科研,。
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使用方法 | 一,、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以10E2-10E7拷貝/μL這6個(gè)10倍稀釋度為例）,。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行,，千萬(wàn)不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）,。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽(yáng)性對(duì)照,，只提供無(wú)傳染性的DNA片段作為陽(yáng)性對(duì)照,。 - 標(biāo)記6個(gè)離心管，分別為7,，6,，5，4,，3,，2。
- 用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR模板稀釋液,，用帶芯槍頭,，下同）。
- 在7號(hào)管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(試劑盒提供),，充分震蕩1分鐘,，得1×10E7拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用,。
- 換槍頭,，在6號(hào)管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得),，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用,。
- 換槍頭，在5號(hào)管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得),，充分震蕩1分鐘,，得1×10E5拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用,。
- 重復(fù)上面的操作直到得到6個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用。
二,、樣品DNA的制備 - 如果有N個(gè)樣品,，設(shè)置N+2個(gè)提取，多出的一個(gè)是PC（樣品制備陽(yáng)性對(duì)照）,，一個(gè)是NC（樣品制備陰性對(duì)照）,。可以用10μL陽(yáng)性對(duì)照的10000倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣,，以此作為PC,。另外用水作為NC。
- 用自選方法純化樣品的DNA,，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)鞭毛蟲(chóng)DNA提取試劑盒兼容,。本試劑盒免費(fèi)贈(zèng)送20次免DNA提取的天凈沙核酸釋放劑，本產(chǎn)品的裂解液可以直接作為PCR模板,，省略了DNA提取步驟,。其使用手冊(cè)可從本公司網(wǎng)站。
三,、Probe qPCR反應(yīng)（20μL體系,，在樣品制備室進(jìn)行） - 如果做定量分析并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+9個(gè)PCR管,，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品,，1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照，6個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線,。如果做定性分析,，并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+4個(gè)PCR管,，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品,，1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照（用水做模板）,，1個(gè)用于PCR陽(yáng)性對(duì)照（用第4號(hào)陽(yáng)性對(duì)照稀釋液,，濃度為10000拷貝/μL）,。下面只描述定量分析的步驟，定性分析只是把6個(gè)標(biāo)曲反應(yīng)縮減成1個(gè),，其余不變,。
- 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照,，并且陽(yáng)性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好后后加）：
成分 | 樣品管 N+2個(gè) | PCR陰性對(duì)照管 | 標(biāo)準(zhǔn)曲線 樣品管（2-7管） | 2×Probe qPCR MagicMix | 10 μL | 10 μL | 各10 μL | 藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)探針?lè)?/span>qPCR探針 | 2 μL | 2 μL | 各2 μL | 藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(chóng)探針?lè)╭PCR引物混合液 | 2 μL | 2 μL | 各2 μL | 待測(cè)樣品DNA模板 | 6 μL | 不加 | 不加 | 第7步所得標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品稀釋液（2-7號(hào)） | 不加 | 不加 | 各6μL（2號(hào)樣到2號(hào)管,，3號(hào)樣到3號(hào)管…） |
- 蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行PCR：
過(guò)程 | 溫度 | 時(shí)間 | 預(yù)變性 | 95℃ | 10 min | PCR反應(yīng) （40個(gè)循環(huán)） | 95℃ | 15 sec | 60℃ | 60 sec（采集FAM通道的熒光信號(hào)） |
五,、數(shù)據(jù)處理 - 如果把本試劑盒用于定量檢測(cè),，則以陽(yáng)性對(duì)照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸,，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,。再以待測(cè)樣品的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度,。
- 如果把本試劑盒用于定性檢測(cè),，只判斷陽(yáng)性或陰性，則陰性對(duì)照Ct必須大于或等于40,。陽(yáng)性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng),，有典型擴(kuò)增曲線，Ct值應(yīng)該小于或等于30,。對(duì)待測(cè)樣品,，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于35則為陽(yáng)性,。如果在35-40之間,，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的Ct值如果大于或等于40則為陰性,，如果小于40,，則為陽(yáng)性。
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