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草魚呼腸孤病毒2型RT-PCR試劑盒說明書
閱讀：270 發(fā)布時間：2019-8-13草魚呼腸孤病毒2型RT-PCR試劑盒
中英文名稱 | 規(guī)格 | 價格 | 說明書 |
Grass carp reovirus(GCRV) 草魚呼腸孤病毒2型RT-PCR試劑盒 | 50次 | 1990元 |
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運輸：低溫 保存：負20度 有效期：一年 貨期：2-3周 | |||
產(chǎn)品及特點
1. 即開即用，用戶只需要提供病毒樣品,。
2. 根據(jù)草魚呼腸孤病毒2型RT-保守序列設計的專一性引物,，與相關(guān)病毒無交叉反應。
3. 靈敏度可以達到幾百拷貝/反應,。
4. 一管式熒光定量PCR檢測,，避免后續(xù)污染。
5. 本試劑盒足夠50次20μL反應體系的熒光定量PCR,。
本產(chǎn)品只適用于科研,，不能用于臨床診斷,。
規(guī)格及成分
成分 | 編號 | 十孔盒包裝 |
2×qPCR MagicMix | 試劑一 | 500μL（棕色管） |
熒光PCR模板稀釋液 | 試劑二 | 1 mL（黃蓋） |
草魚呼腸孤病毒2型RT-PCR引物混合物 | 試劑三 | 100μL（白蓋） |
草魚呼腸孤病毒2型RT-PCR陽性對照 (1×10E8 拷貝/μL) | 試劑四 | 50μL（紅蓋） |
使用手冊 | 試劑五 | 1份 |
運輸及保存
低溫運輸，-20℃保存,，保存期限一年,。
自備試劑
DNA模板、10×ROX（根據(jù)機型決定,，具體見使用方法）,。
使用方法
一、稀釋PCR陽性對照（以10E2-10E7拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例）
1. 注意：由于標準品濃度非常高,，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行,，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原,，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照,，只提供可以直接使用的DNA片段作為陽性對照。
2. 標記6個離心管,，分別為7,，6，5,，4,，3，2,。
3. 用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR模板稀釋液（用帶芯槍頭,，下同）。
4. 在7號管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽性對照,，充分震蕩1分鐘,，得1×10E7拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用,。
5. 換槍頭,，在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘,，得1×10E6拷貝/μL的陽性對照,。放冰上待用。
6. 換槍頭,，在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL的陽性對照到5號管中,，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的陽性對照,。放冰上待用,。
7. 重復上面的操作直到得到6個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。
二,、樣品DNA的制備
8. 如果有N個樣品,，必須設置N+2個提取，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照）,，一個是NC（樣品制備陰性對照）,。可以用10μL上步制備的PCR陽性對照的第4號（濃度為1×10E4 拷貝/μL,，10μL相當于1萬拷貝）或第5號（濃度為1×10E5 拷貝/μL,，10μL相當于10萬拷貝）再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣,，以此作為PC,。另外用水作為NC。如果每次制備需要200μL樣品,，則PC和NC的體積也必須是200μL,。
9. 用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒DNA提取試劑盒兼容,。
三,、設置qPCR反應（20 μL體系，在樣品制備室進行）
10. 如果只做1次重復,，則標記N+9個PCR管,，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照,，6個用于PCR陽性對照,。如果做2-3次重復，則反應設置數(shù)量相應增加2或3倍,。
11. 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復,。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后加）：
成分 | 樣品管 N+2個 | PCR陰性對照管 | PCR陽性 對照管（2-7管） |
2×qPCR MagicMix （棕色管） | 10 μL | 10 μL | 各10 μL |
草魚呼腸孤病毒2型RT-PCR 引物混合液（白蓋） | 2 μL | 2 μL | 各2 μL |
自備10×ROX (見注) | 2 μL | 2 μL | 各2 μL |
N+2待測樣品DNA模板 | 6 μL | 不加 | 不加 |
第7步所得PCR陽性對照 稀釋液（2-7號） | 不加 | 不加 | 各6μL（2號樣到2號管,，3號樣到3號管…） |
注:僅ABI7500,、7700和7900儀器需要使用ROX作為對照，其他熒光PCR儀器（如iCycler IQ,、MJ Option,、MJ Chromo4、MX3000,、MX4000,、RotorGene 3000、RotorGene 6000和LightCycler480）不需要使用ROX,，則用水替代,。
12. 蓋上蓋子后上機，按下面參數(shù)進行PCR（具體PCR參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行優(yōu)化）,。
過程 | 溫度 | 時間 |
預變性 | 92℃ | 5分鐘 |
PCR反應 （30個循環(huán)） | 92℃ | 60 秒 |
54℃ | 60 秒 | |
72℃ | 60 秒 |
13. 數(shù)據(jù)采集
具體操作按所用儀器推薦的流程進行,。本產(chǎn)品中所含的熒光染料在不結(jié)合DNA時,，大吸收光譜在471 nm，結(jié)合DNA時的大吸收光譜在500 nm,，大發(fā)射光譜在530 nm,。信號采集可以設置在復性或延伸步驟。
四,、數(shù)據(jù)處理
14. 如果把本試劑盒用于定量檢測,，則以陽性對照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸,，繪制標準曲線,。再以待測樣品的Ct值從標準曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度,。
如果把本試劑盒用于定性檢測,，只判斷陽性或陰性，則陰性對照Ct必須大于或等于40,。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長,，有典型擴增曲線，Ct值應該小于或等于30,。對待測樣品,，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于35則為陽性,。如果在35-40之間,，則重復一次。重復實驗的Ct值如果大于或等于40則為陰性,，如果小于40,，則為陽性。