產(chǎn)品及特點(diǎn) | 牛細(xì)小病毒(Bovine Parvovirus,BPV) 會(huì)引發(fā)牛細(xì)小病毒感染,，是一種接觸性傳染病,以下痢為主要癥狀,其特征是母牛生殖機(jī)能障礙,，導(dǎo)致妊娠母牛感染導(dǎo)致流產(chǎn),、死胎,，犢牛感染則表現(xiàn)腸炎、腹瀉,。牛細(xì)小病毒感染在牛群中發(fā)生比較廣泛,，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)其研究的較少,發(fā)生此病的國(guó)家也不多，本產(chǎn)品就是以染料法熒光定量PCR技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測(cè)牛細(xì)小病毒的試劑盒,，它具有下列特點(diǎn)： - 即開即用,，用戶只需要提供樣品DNA模板。
- 引物和探針經(jīng)過(guò)優(yōu)化,，靈敏性高,。
- 提供陽(yáng)性對(duì)照，便于區(qū)分假陰性樣品,。
- 特異性高,，引物是根據(jù)牛細(xì)小病毒高度保守區(qū)設(shè)計(jì)，不會(huì)跟其他病毒的DNA發(fā)生交叉反應(yīng),。
- 本產(chǎn)品足夠50次20μL體系的探針法熒光定量PCR反應(yīng),。
- 本產(chǎn)品只能用于科研。
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規(guī)格及成分 | 成分 | 編號(hào) | 十孔盒包裝 | 2×Probe qPCR MagicMix | 190303 | 0.5 mL（本色蓋） | 熒光PCR模板稀釋液 | 180701 | 1 mL（黃蓋） | 牛細(xì)小病毒 PCR引物 | 15-44000yw | 100 μL（白蓋） | 牛細(xì)小病毒 qPCR探針 | 15-44000pro | 100 μL（棕色管） | 牛細(xì)小病毒陽(yáng)性對(duì)照2.0 (1×10E8拷貝/μL) | 15-44000pc | 50 μL（紅蓋） | 天凈沙核酸釋釋劑試用裝 | 61202 | 50次（2.5mL） | 使用手冊(cè) | 15-44000sc | 1份 |
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運(yùn)輸及保存 | 低溫運(yùn)輸,，-20℃保存,，保存期限為12個(gè)月,。 | |
自備試劑 | 樣品DNA。 | |
使用方法 | 一,、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以10E2-10E7拷貝/μL這6個(gè)10倍稀釋度為例）,。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行,，千萬(wàn)不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）,。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽(yáng)性對(duì)照,，只提供無(wú)傳染性的DNA片段作為陽(yáng)性對(duì)照,。 - 標(biāo)記6個(gè)離心管，分別為7,，6,，5，4,，3,，2。
- 用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR模板稀釋液,，用帶芯槍頭,，下同）。
- 在7號(hào)管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(試劑盒提供),，充分震蕩1分鐘,，得1×10E7拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用,。
- 換槍頭,，在6號(hào)管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘,，得1×10E6拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用。
- 換槍頭,，在5號(hào)管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得),，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用,。
- 重復(fù)上面的操作直到得到6個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用,。
二,、樣品DNA的制備 - 如果有N個(gè)樣品，設(shè)置N+2個(gè)提取,，多出的一個(gè)是PC（樣品制備陽(yáng)性對(duì)照）,，一個(gè)是NC（樣品制備陰性對(duì)照）,。可以用10μL陽(yáng)性對(duì)照的10000倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣,，以此作為PC,。另外用水作為NC。
- 用自選方法純化樣品的DNA,，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)病毒DNA提取試劑盒兼容,。也可以選購(gòu)本公司的柱式病毒DNAout。本試劑盒免費(fèi)贈(zèng)送50次免DNA提取的天凈沙核酸釋放劑試用裝,，該釋放劑的裂解液可以直接作為PCR模板,，省略了DNA提取步驟。
三,、Probe qPCR反應(yīng)（20μL體系,，在樣品制備室進(jìn)行） - 如果只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+9個(gè)PCR管,，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品,，1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照，6個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。
- 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù),。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照,，并且陽(yáng)性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好后后加）：
成分 | 樣品管 N+2個(gè) | PCR陰性對(duì)照管 | 標(biāo)準(zhǔn)曲線 樣品管（2-7管） | 2×Probe qPCR MagicMix | 10 μL | 10 μL | 各10 μL | 牛細(xì)小病毒 qPCR探針 | 2 μL | 2 μL | 各2 μL | 牛細(xì)小病毒 PCR引物混合液 | 2 μL | 2 μL | 各2 μL | 待測(cè)樣品DNA模板 | 6 μL | 不加 | 不加 | 第7步所得標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品稀釋液（2-7號(hào)） | 不加 | 不加 | 各6μL（2號(hào)樣到2號(hào)管,，3號(hào)樣到3號(hào)管…） |
- 蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行PCR：
過(guò)程 | 溫度 | 時(shí)間 | 預(yù)變性 | 94℃ | 5 min | PCR反應(yīng) （40個(gè)循環(huán)） | 94℃ | 0.5 min | 55℃ | 0.5 min（采集FAM通道的熒光信號(hào)） | 72℃ | 0.5 min | 后延伸 | 72℃ | |
- 如果把本試劑盒用于定量檢測(cè),，則以陽(yáng)性對(duì)照濃度的log值為橫軸,，以Ct值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,。再以待測(cè)樣品的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品DNA濃度的log值,，再推算出其濃度。
- 如果把本試劑盒用于定性檢測(cè),，只判斷陽(yáng)性或陰性,，則陰性對(duì)照Ct必須大于或等于40。陽(yáng)性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng),，有典型擴(kuò)增曲線,，Ct值應(yīng)該小于或等于30。對(duì)待測(cè)樣品,，如果其Ct大于或等于40則為陰性,，如果小于或等于35則為陽(yáng)性。如果在35-40之間,，則重復(fù)一次,。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的Ct值如果大于或等于40則為陰性,，如果小于40，則為陽(yáng)性,。
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成分 | 編號(hào) | 十孔盒包裝 | 2×Probe qPCR MagicMix | 190303 | 0.5 mL（本色蓋） | 熒光PCR模板稀釋液 | 180701 | 1 mL（黃蓋） | 牛細(xì)小病毒 PCR引物 | 15-44000yw | 100 μL（白蓋） | 牛細(xì)小病毒 qPCR探針 | 15-44000pro | 100 μL（棕色管） | 牛細(xì)小病毒陽(yáng)性對(duì)照2.0 (1×10E8拷貝/μL) | 15-44000pc | 50 μL（紅蓋） | 天凈沙核酸釋釋劑試用裝 | 61202 | 50次（2.5mL） | 使用手冊(cè) | 15-44000sc | 1份 |
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低溫運(yùn)輸,，-20℃保存，保存期限為12個(gè)月,。 | |
樣品DNA,。 | |
一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以10E2-10E7拷貝/μL這6個(gè)10倍稀釋度為例）,。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高,，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬(wàn)不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）,。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原,，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽(yáng)性對(duì)照，只提供無(wú)傳染性的DNA片段作為陽(yáng)性對(duì)照,。 - 標(biāo)記6個(gè)離心管,，分別為7，6,，5,，4，3,，2,。
- 用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR模板稀釋液，用帶芯槍頭,，下同）,。
- 在7號(hào)管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘,，得1×10E7拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用。
- 換槍頭,，在6號(hào)管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得),，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用,。
- 換槍頭，在5號(hào)管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得),，充分震蕩1分鐘,，得1×10E5拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
- 重復(fù)上面的操作直到得到6個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用,。
二、樣品DNA的制備 - 如果有N個(gè)樣品,，設(shè)置N+2個(gè)提取,，多出的一個(gè)是PC（樣品制備陽(yáng)性對(duì)照），一個(gè)是NC（樣品制備陰性對(duì)照）,?？梢杂?0μL陽(yáng)性對(duì)照的10000倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC,。另外用水作為NC,。
- 用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)病毒DNA提取試劑盒兼容,。也可以選購(gòu)本公司的柱式病毒DNAout,。本試劑盒免費(fèi)贈(zèng)送50次免DNA提取的天凈沙核酸釋放劑試用裝，該釋放劑的裂解液可以直接作為PCR模板,，省略了DNA提取步驟,。
三、Probe qPCR反應(yīng)（20μL體系,，在樣品制備室進(jìn)行） - 如果只做1次重復(fù),，則標(biāo)記N+9個(gè)PCR管，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品,，1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照,，6個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。
- 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù),。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照,，并且陽(yáng)性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好后后加）：
成分 | 樣品管 N+2個(gè) | PCR陰性對(duì)照管 | 標(biāo)準(zhǔn)曲線 樣品管（2-7管） | 2×Probe qPCR MagicMix | 10 μL | 10 μL | 各10 μL | 牛細(xì)小病毒 qPCR探針 | 2 μL | 2 μL | 各2 μL | 牛細(xì)小病毒 PCR引物混合液 | 2 μL | 2 μL | 各2 μL | 待測(cè)樣品DNA模板 | 6 μL | 不加 | 不加 | 第7步所得標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品稀釋液（2-7號(hào)） | 不加 | 不加 | 各6μL（2號(hào)樣到2號(hào)管,，3號(hào)樣到3號(hào)管…） |
- 蓋上蓋子后上機(jī),，按下面參數(shù)進(jìn)行PCR：
過(guò)程 | 溫度 | 時(shí)間 | 預(yù)變性 | 94℃ | 5 min | PCR反應(yīng) （40個(gè)循環(huán)） | 94℃ | 0.5 min | 55℃ | 0.5 min（采集FAM通道的熒光信號(hào)） | 72℃ | 0.5 min | 后延伸 | 72℃ | |
- 如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以陽(yáng)性對(duì)照濃度的log值為橫軸,，以Ct值為縱軸,，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品DNA濃度的log值,，再推算出其濃度,。
- 如果把本試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽(yáng)性或陰性,，則陰性對(duì)照Ct必須大于或等于40,。陽(yáng)性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，有典型擴(kuò)增曲線，Ct值應(yīng)該小于或等于30,。對(duì)待測(cè)樣品,，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于35則為陽(yáng)性,。如果在35-40之間,，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的Ct值如果大于或等于40則為陰性,，如果小于40,，則為陽(yáng)性。
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牛細(xì)小病毒可視化LAMP檢測(cè)試劑盒 | |
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