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大鼠大腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)
閱讀：1081 發(fā)布時(shí)間：2019-4-24實(shí)驗(yàn)方法原理 SD胎鼠腦皮層神經(jīng)元體外培養(yǎng)7 d ,，微量移液器塑料滴頭于培養(yǎng)孔內(nèi)機(jī)械性劃割培養(yǎng)之神經(jīng)元，依劃割程度不同分為輕,、中,、重3組，對照組除不進(jìn)行機(jī)械性劃割,，其余處理同損傷組,，傷后不同時(shí)間點(diǎn)（10，30 min ,， 1,，3，6,，12，24 h）檢測細(xì)胞存活率及培養(yǎng)液上清乳酸脫氫酶(LDH)含量,。
實(shí)驗(yàn)材料 SD大鼠
試劑,、試劑盒 硼酸硼砂緩沖液胰酶-EDTA 消化液D-Hanks’
儀器、耗材 眼科剪滴管離心機(jī)培養(yǎng)皿 CO2培養(yǎng)箱
實(shí)驗(yàn)步驟
一,、實(shí)驗(yàn)步驟
1. 孕16 d SD 大鼠經(jīng)麻醉后,，碘酒、75%乙醇消毒腹部皮膚,，依次剪開皮膚,、肌肉,、皮下筋膜，無菌操作下取出胚胎放入預(yù)冷的D-Hanks’平衡鹽液中,。
2. 在解剖顯微鏡下分離并取出胚胎大腦皮層,，除去腦膜，剪碎組織成約1mm3 大小,，加入胰酶-EDTA 消化液并放入 37℃孵箱內(nèi)消化20 min,，中間搖晃一次。
3. 隨后用滴管吸出組織轉(zhuǎn)移到裝有預(yù)冷的培養(yǎng)液(DMEM＋10%FBS)的離心管內(nèi)終止消化液作用5 min,。
4. 用滴管吸出組織轉(zhuǎn)移到裝有預(yù)冷的 DMEM＋10%FBS 的離心管內(nèi),，用火焰拋光的巴斯德滴管吹打數(shù)次，靜置后取上清吸到另一支離心管內(nèi),。重復(fù)上述步驟 2～3 次,。
5. 將所收集的上清經(jīng)200 目篩網(wǎng)過濾。
6. 過濾后的細(xì)胞懸液于800 rpm 離心5 min,，棄上清,，管內(nèi)加入新鮮培養(yǎng)液(DMEM＋20%FBS)并吹打 成單細(xì)胞懸液。
7. 細(xì)胞計(jì)數(shù),，調(diào)整細(xì)胞密度按1.5x105/cm2 種入6 孔板內(nèi),，放入CO2 孵箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)48 h 后換液并 加入Ara-C使其終濃度為 1x10-5 mM/L,。Ara-C作用24 h 后全量換液,。以后每隔 3 天半量換液一次。
收起
注意事項(xiàng)
1. 上面的步驟是傳統(tǒng)方法,。有許多地方可以進(jìn)行改動：如消化時(shí)可以直接用0.125-0.25%的胰酶消 化15-20 min 左右,，也可用 DNA 酶進(jìn)行消化，有人還直接進(jìn)行吹打,，都可行,。
2. 上面雖然時(shí)大鼠皮層神經(jīng)元，但是同樣適用于小鼠,，但是應(yīng)該選擇孕13 d 左右的小鼠,。
3. 神經(jīng)元是一種比較難培養(yǎng)的細(xì)胞，因此在接種時(shí)細(xì)胞的密度一定要夠,。
4. 在玻片上培養(yǎng)神經(jīng)元時(shí),，一定要注意玻片的來源和處理方法，這個(gè)非常重要,，對神經(jīng)細(xì)胞的影響 是很大的,。如果您現(xiàn)在在玻片上培養(yǎng)的神經(jīng)元生長情況還不錯(cuò)的話，那么您在以后的培養(yǎng)中還是用同 一來源(廠家)的玻片,。
5. 如果有B27 和neurobasal 培養(yǎng)基,，那么就方便了(不用加 AraC):
(1)把細(xì)胞懸液用(DMEM＋20%FBS)懸浮,，種到培養(yǎng)皿上6－12 h 后，全量換成 2% B27 的 neurobasal 培養(yǎng)基,，繼續(xù)培養(yǎng),，3 d 半量換液。
(2)把細(xì)胞懸液用直接用 2% B27 的 neurobasal 培養(yǎng)基懸浮接種,。
(3)可以用新生1 d 內(nèi)的胎鼠皮層直接培養(yǎng),。
酶消化法
實(shí)驗(yàn)材料 小鼠
試劑、試劑盒 酒精解剖液胰蛋白酶DMEM F12B27阿糖胞苷培養(yǎng)液
儀器,、耗材 培養(yǎng)箱
實(shí)驗(yàn)步驟
一,、小鼠大腦皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng)步驟
1. 于無菌條件下切取鼠頭并以75%酒精浸泡1 min，解剖出完整鼠腦,。
2. 預(yù)冷解剖液中分離去除軟膜,、血管、取大腦皮質(zhì)漂洗,，用眼科剪將皮質(zhì)反復(fù)剪切成碎塊,。
3. 移入培養(yǎng)皿中，吸除解剖液加入0.25%胰蛋白酶2 ml,，37℃培養(yǎng)箱中消化30 min,。
4. 將皮層組織碎塊移入離心管，棄去剩余消化液,，用接種液洗3次,，每次洗滌后使組織塊充分沉降到試管底，棄去上清液,。
5. 后再用接種液1 ml混懸,，反復(fù)吹打（巴氏吸管）混懸液中組織塊，力度適中,，至渾濁后將上清液移入培養(yǎng)瓶待用,。
6. 加入1ml接種液后再次吹打，如此反復(fù)3-4次,，組織塊逐漸消化后,，棄去終殘塊。
7. 收集含單細(xì)胞懸液的上清液約4-5 ml于培養(yǎng)瓶中,，以接種液重新懸浮細(xì)胞,，細(xì)胞記數(shù)；接種1x107個(gè)細(xì)胞于6孔培養(yǎng)板中,。
8. 培養(yǎng)24 h至細(xì)胞貼壁后，換全培養(yǎng)液（DMEM/F12+2%B27）培養(yǎng)3d,，觀察神經(jīng)元生長狀況,。
9. 換用阿糖胞苷培養(yǎng)液,、 每隔3d換全培養(yǎng)液1次，每次換半液,。
二,、神經(jīng)元免疫化學(xué)鑒定
1. 4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，PBS洗滌3次,。
2. 加入無水甲醇:30%雙氧水（5:1）處理30 min,，PBS洗滌3次。
3. 加入5%羊血清封閉20 min,，棄去多余液體,。
4. 加入Rabbit Anti-NSE（1:100）（神經(jīng)元特異性烯醇化酶），培養(yǎng)箱中孵育2-4 h,，PBS洗滌3次,。
6. 加入DAPI染液（1:40），室溫放置5-10 min,；PBS洗滌3次,。
7. 熒光顯微鏡觀察。
三,、結(jié)果
圖1： 剛接種時(shí)細(xì)胞圖
圖2： 剛接種時(shí)細(xì)胞圖培養(yǎng)1d后
圖3： 剛接種時(shí)細(xì)胞圖培養(yǎng)2d后
圖4： 剛接種時(shí)細(xì)胞圖培養(yǎng)3d后
圖5： 剛接種時(shí)細(xì)胞圖培養(yǎng)4d后
圖6： 剛接種時(shí)細(xì)胞圖培養(yǎng)5d后
圖7： 剛接種時(shí)細(xì)胞圖培養(yǎng)6d后
圖8：第7d免疫鑒定圖