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羊痘病毒實時熒光RT-PCR試劑盒
閱讀：470 發(fā)布時間：2019-3-22通用名稱：羊痘病毒實時熒光RT-PCR試劑盒
【包裝規(guī)格】 25T/盒 & 50T/盒
【預期用途】
本試劑盒利用實時熒光PCR原理,，定性檢測,，對引起的疾病診斷及療效評估有重要指導意義。
【檢驗原理】
本試劑盒針對的高度保守區(qū)域設計特異性引物和探針，在反應體系中含基因組模板的情況下，PCR反應得以進行并釋放熒光信號,。利用熒光定量PCR儀對PCR過程中相應通道信號進行實時監(jiān)測和輸出,，實現檢測結果的定性分析。
羊痘病毒實時熒光RT-PCR試劑盒【主要組成成份】
序號 | 組成 | 25T/盒 | 50T/盒 |
1 | RT-PCR反應液 | 375 μL×1管 | 750 μL×1管 |
2 | 逆轉錄酶 | 50 μL×1管 | 100 μL×1管 |
3 | Taq酶 | 75 μL×1管 | 150 μL×1管 |
4 | 陽性對照 | 40 μL×1管 | 40 μL×1管 |
5 | 陰性對照 | 40 μL×1管 | 40 μL×1管 |
6 | 說明書 | 1份 | 1份 |
注：陰性對照為偶蹄獸類基因組DNA,，陽性對照為失去活性的cDNA,。
【儲存條件及有效期】避光-20℃以下保存，避免反復凍融,，有效期12個月,。
【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列,、Agilent Stratagene MX系列,、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler,、Rotor-Gene系列,、杭州博日系列等多通道實時熒光定量PCR儀,。
【樣本要求】
1. 適用標本類型：發(fā)病動物血液,、空腸及小腸腸內容物及組織臟器(腸道組織、腸系膜及淋巴結等)和病毒培養(yǎng)液,。
2. 標本采集,，方法如下：
(1) 血清：用一次性注射器取靜脈血2-3ml，轉至5ml 的干燥管中,，密閉送檢,。
(2) 腸內容物：無菌條件下取腸道內容物約1g 左右，置入1ml 含有1.0ml PBS(或生理鹽水)的5ml 離心管中,，立即送檢,。
(3) 組織臟器：取發(fā)病動物腸道組織及腸系膜淋巴結等組織約1g，置一1.5ml的潔凈離心管中,，密閉送檢,。
3.應避免標本間交叉污染。
4.標本收集后可立即檢測,；若不能立即檢測,，可置于2～8℃冷藏保存；如需長期保存,，標本應凍存于-80℃以下,，避免反復凍融。
羊痘病毒實時熒光RT-PCR試劑盒【檢驗方法】
1. 試劑準備（試劑準備區(qū)）
（1）從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實驗所需試劑,，充分融化混勻并瞬時離心以去除管壁附著液體,。
（2）核算當次實驗所需要的反應數（n），并根據如下表所示反應體系計算當次實驗所需要的各種試劑量,。
n =陰性對照數（1T）+陽性對照數（1T）+誤差預留量（1T）+樣本數
單反液配制表(每份) | RT-PCR反應液 | 15.0 μL |
逆轉錄酶 | 2.0 μL | |
Taq酶 | 3.0 μL |
(3)在無菌離心管中加入上述試劑,，充分混勻后瞬時離心,。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應管。
2.樣本準備（樣本處理區(qū)）
用QIAGEN,、Roche公司RNA提取試劑盒提取RNA,，具體操作按照其試劑盒說明書操作。
3.加樣
在上述制備好的PCR反應樣本管中分別加入處理好的待測標本RNA各5 μl,、終體積25 μl/管,，蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時低速離心，轉移到PCR儀器上,。陰性對照和陽性對照管則各加5 μL試劑盒自帶的陰性對照或陽性對照品,，終體積為25 μl/管，蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時低速離心,，轉移到PCR儀器上,。
4. PCR（PCR擴增區(qū)）
（1）取樣本處理區(qū)準備好的PCR反應管,，放置在實時熒光定量PCR儀樣品槽相應位置,，并記錄放置順序。
（2）按下表設置儀器核酸擴增相關參數進行PCR擴增,。羊痘病毒實時熒光RT-PCR試劑盒
反應體積 | 25 μL | 通道選擇 | FAM通道采集熒光信號 |
PCR 反應 條件 | 步驟 | 條件 | 循環(huán)數 |
反轉錄 | 42℃：10分鐘（min） | 1 | |
預變性 | 95℃：3分鐘（min） | 1 | |
預擴增 | 95℃：5秒（s） | 5 | |
55℃：40秒（s） | |||
PCR擴增 | 95℃：5秒（s） | 40 | |
55℃：40秒（s） （此階段結束時采集熒光信號） |
注：ABI系列熒光PCR儀在設置時不選ROX校正,，設置淬滅基團選擇None,。
【參考值（參考范圍）】
1.試劑盒有效性判定：
（1）陽性對照：有典型S型擴增曲線或Ct值≤35。
（2）陰性對照：Ct值＞38或無Ct值,，線形為直線或輕微斜線,，無指數增長期。
2.標本結果判定：
（1）陽性：標本檢測結果Ct值≤35或有明顯指數增長期,。
（2）可疑：標本檢測結果Ct值在35～38范圍內,。此時應對標本進行重復檢測，如重復實驗結果Ct值仍在35～38范圍內,，有明顯指數增長期,，則判定為陽性，否則為陰性,。
（3）陰性：標本檢測結果Ct值＞38或無Ct值,。
【檢驗結果的解釋】
通道及檢測結果 | 標本檢測結果解釋 |
FAM | |
陽性（＋） | 標本中檢出RNA |
陰性（－） | 標本中未檢出RNA |
【檢驗方法的局限性】
- 當檢測樣本中被檢核酸濃度低于本試劑盒的低檢出*可能會發(fā)生假陰性的結果。
- 被檢樣本在采集,、運輸,、儲存以及處理過程中操作方式不當容易造成RNA降解而產生假陰性結果。
- 樣本在采集,、運輸,、儲存以及處理過程中發(fā)生交叉污染，則容易得到假陽性結果,。
【產品性能指標】 產品的低檢出限為102 Copies/mL,，產品CV值≤5%,。
【注意事項】
- 整個檢測過程應嚴格按照本說明書要求分別在試劑準備區(qū)、樣本處理區(qū)和PCR擴增區(qū)進行操作,，各區(qū)實驗服,、儀器、耗材應獨立使用,，不能混用,；實驗用吸頭采用帶濾芯吸頭；樣本處理區(qū)應配有生物安全柜,，樣本處理在生物安全柜中進行操作,；三個區(qū)應該配有紫外線殺菌裝置。
- 為避免RNA降解,，樣本處理過程應在0-4℃條件下操作,，且完成實驗后立即上機檢測；樣本處理過程中使用的器具耗材應經過無核酶處理,。
- 每次實驗應該設置陰,、陽性對照。
- 試劑盒所有試劑在使用前應該在常溫下充分融化混勻,，并應瞬時離心,。
- 試劑盒內所配陰性和陽性對照在次使用前應全部轉移至標本準備區(qū),，并單獨存放,。
- 為防止熒光干擾，應避免裸手直接接觸PCR反應管,，并應避免在PCR反應管上進行任何標記,。
- 儀器擴增相關參數應按照本說明書相關要求進行設置；不同批號試劑不能混用,。
- ABI系列熒光定量PCR儀參數設置中不選ROX校正,，淬滅基因選擇None。
- 實驗過程中產品的廢棄物應該進行無害化處理后方可丟棄,。
羊痘病毒實時熒光RT-PCR試劑盒