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實(shí)驗(yàn)方法原理    細(xì)胞凋亡中, 染色體DNA 雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產(chǎn)生大量的粘性3'-OH 末端,，可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下,，將脫氧核糖核苷酸和熒光素,、過(guò)氧化物酶,、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到DNA 的3'-末端,，從而可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測(cè)，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling,TUNEL）,。由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒(méi)有DNA 的斷裂,，因而沒(méi)有3'-OH形成，很少能夠被染色,。

TUNEL 實(shí)際上是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法,，對(duì)完整的單個(gè)凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色，能準(zhǔn)確地反應(yīng)細(xì)胞凋亡典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征,，可用于石蠟包埋組織切片,、冰凍組織切片、培養(yǎng)的細(xì)胞和從組織中分離的細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)測(cè)定,，并可檢測(cè)出極少量的凋亡細(xì)胞,，因而在細(xì)胞凋亡的研究中被廣泛采用。

Caspase-3 活性的檢測(cè)
實(shí)驗(yàn)方法原理    Caspase 家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過(guò)程中起著非常重要的作用,， 其中caspase-3 為關(guān)鍵的執(zhí)行分子,，它在凋亡信號(hào)傳導(dǎo)的許多途徑中發(fā)揮功能。Caspase-3 正常以酶原（32KD）的形式存在于胞漿中,，在凋亡的早期階段,，它被激活,，活化的Caspase-3 由兩個(gè)大亞基（17KD）和兩個(gè)小亞基（12KD）組成，裂解相應(yīng)的胞漿胞核底物,，終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,。但在細(xì)胞凋亡的晚期和死亡細(xì)胞，caspase-3 的活性明顯下降,。
 
實(shí)驗(yàn)步驟    
一,、Western blot 分析Procaspase-3 的活化，以及活化的Caspase-3 及對(duì)底物多聚（ADP-核糖）聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase,，PARP]等的裂解,。

方法：收集細(xì)胞→PBS 洗滌→抽提細(xì)胞裂解液→蛋白定量→SDS-PAGE 電泳→硝酸纖維素膜或PVDF 膜轉(zhuǎn)移→5 %脫脂奶粉封閉，室溫1.5~2 h 或4 °C 過(guò)夜→Caspase-3 多抗或單抗室溫反應(yīng)1~2 h 或4 °C 過(guò)夜→TBS-T（含0.05% Tween 20的TBS）洗3 次,，5~10 min/次→HRP-標(biāo)記的羊抗鼠IgG 或AP 標(biāo)記的羊抗鼠IgG室溫反應(yīng)1~2 h→ TBS-T 洗3 次,， 5~10 min/次→ECL 顯影或NBT/BCIP 顯色。
 
二,、熒光分光光度計(jì)分析
 
1.  原理：活化的Caspase-3 能夠特異切割D1E2V3D4-X 底物,，水解D4-X 肽鍵。根據(jù)這一特點(diǎn),，設(shè)計(jì)出熒光物質(zhì)偶聯(lián)的短肽Ac-DEVD-AMC,。在共價(jià)偶聯(lián)時(shí)，AMC不能被激發(fā)熒光,，短肽被水解后釋放出AMC,，自由的AMC 才能被激發(fā)發(fā)射熒光。根據(jù)釋放的AMC 熒光強(qiáng)度的大小,，可以測(cè)定caspase-3 的活性,，從而反映Caspase-3 被活化的程度。
 
2.  方法：收獲細(xì)胞正?；虻蛲黾?xì)胞,，PBS 洗滌，制備細(xì)胞裂解液加Ac-DEVD-AMC（caspase-3 四肽熒光底物）,，37 °C 反應(yīng)1 h,，熒光分光光度計(jì)（Polarstar）分析熒光強(qiáng)度（激發(fā)光波長(zhǎng)380 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為430-460 nm）,。
 
三,、流式細(xì)胞術(shù)分析
 
方法：收獲細(xì)胞正?；虻蛲黾?xì)胞,，PBS 洗滌，加Ac-DEVD-AMC 37 °C 反應(yīng)1 hUV 流式細(xì)胞計(jì)分析caspase-3 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和平均熒光強(qiáng)度,。