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PCR-SSCP 技術(shù)實(shí)驗(yàn)
閱讀：747 發(fā)布時(shí)間：2019-3-18聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-單鏈構(gòu)象多態(tài)（Polymerase Chain Reaction-Single Strand Conformation Polymorphism，PCR-SSCP）技術(shù)可用于：（1）癌基因和抑癌基因突變的篩查檢測(cè),；（2）遺傳病的致病基因分析,；（3）基因診斷，基因制圖等領(lǐng)域,。
實(shí)驗(yàn)方法原理 PCR-SSCP技術(shù)的基本原理是PCR擴(kuò)增后的DNA片段經(jīng)變性成單鏈DNA,，單鏈DNA在中性聚丙烯酰胺凝膠中電泳時(shí)形成不同的立體構(gòu)象，其構(gòu)象直接影響泳動(dòng)速率,，相同長(zhǎng)度的 DNA單鏈其核苷酸順序僅有單個(gè)堿基的差別,，就可以產(chǎn)生立體構(gòu)象的不同，造成泳動(dòng)速率的不同,，產(chǎn)生不同的泳動(dòng)帶,。PCR擴(kuò)增后的DNA片段經(jīng)變性成單鏈后在不含有變性劑的中性膠中電泳，與正常比較出現(xiàn)泳動(dòng)帶的變位即可推測(cè)存在堿基置換,。其堿基置換的性質(zhì)必須經(jīng)過(guò)DNA測(cè)序才能確定,。因此PCR-SSCP檢測(cè)是測(cè)序之前突變篩查的常用手段。
實(shí)驗(yàn)材料 樣本DNA
試劑,、試劑盒 Taq DNA聚合酶PCR反應(yīng)緩沖液引物dNTPs丙烯酰胺TBE緩沖液過(guò)硫酸銨TEMED甲酰胺上樣緩沖液固定液銀染液顯色液
儀器,、耗材 電泳儀水浴鍋電泳槽
實(shí)驗(yàn)步驟
一,、PCR反應(yīng)
20 ml反應(yīng)體系成分如下：
模板DNA（100 ng/ml） 1 ml
10×PCR反應(yīng)緩沖液 2 ml
Taq DNA聚合酶（5 U/ml） 0.2 ml
4×dNTPs（2.5 mmol/L） 1 ml
MTHFR上下游引物 各 1 ml
ddH2O 加至終體積 20 ml
PCR反應(yīng)循環(huán)參數(shù)：
95℃ 5 min,；
94℃ 30 s、62℃ 50 s,、72℃ 90 s,，共30個(gè)循環(huán)；
72℃ 7 min,。
反應(yīng)結(jié)束后,，置4℃保存。
二,、非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳
1. 制備6%的非變性聚丙烯酰胺凝膠：30%聚丙烯酰胺（交聯(lián)度49:1）10 ml,，5×TBE緩沖液10 ml，加蒸餾水至50 ml,，加TEMED 25 ml,、10%過(guò)硫酸銨250 ml，混勻后灌膠,，插入加樣梳子,。待膠*聚合后,，拔出加樣梳子，安裝電泳裝置,，加入電泳緩沖液（1×TBE）,，緩沖液應(yīng)高于加樣孔上緣，用注射器吸取緩沖液沖凈加樣孔,。
2. 取5 ml 擴(kuò)增產(chǎn)物加10 ml變性上樣緩沖液混勻,，98℃變性10 min，迅速冰浴,。
3. 取5 ml混合液加到點(diǎn)樣孔中,，以1——8 V/cm電泳4——5 h。
三,、聚丙烯酰胺凝膠染色
1. 拆下電泳裝置,，取出聚丙烯酰胺凝膠，放到一個(gè)塑料盤(pán)內(nèi),，用蒸餾水沖洗1——2遍,。
2. 倒入固定液，固定8——10 min,。
3. 用蒸餾水沖洗1——2遍,；倒入銀染液，銀染10——12 min,。
4. 用蒸餾水沖洗若干遍,；倒入顯色液，顯色至出現(xiàn)清晰的銀染帶,。
5. 用蒸餾水浸泡聚丙烯酰胺凝膠,，觀察PCR-SSCP結(jié)果。
四,、結(jié)果判斷
觀察并記錄聚丙烯酰胺凝膠上的DNA單鏈帶,，根據(jù)異常泳動(dòng)變位篩查突變樣本。
收起
注意事項(xiàng)
1. 靶DNA序列長(zhǎng)度不宜過(guò)長(zhǎng),，否則靈敏度下降,。
2. DNA樣品在電場(chǎng)中泳動(dòng)的長(zhǎng)度一般要求在16——18 cm以上。
3. 染色在塑料盤(pán)中進(jìn)行,。
4. 環(huán)境溫度越高,，聚丙烯酰胺凝膠越易凝固。應(yīng)根據(jù)環(huán)境溫度的變化調(diào)整
凝膠中10％過(guò)硫酸銨與TEMED的用量,。
5. 電泳過(guò)程中應(yīng)保持恒溫,，使用薄的凝膠和冷卻系統(tǒng)以散發(fā)熱量。
6. 用AgNO3染色時(shí)，染色時(shí)間需隨環(huán)境溫度變化作適當(dāng)調(diào)整,，環(huán)境溫度越
低,，所需的染色時(shí)間越長(zhǎng)。
7. 顯色時(shí)間不可過(guò)長(zhǎng),，以免背景過(guò)深影響結(jié)果觀察,。