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【產(chǎn)品名稱】

通用名稱：高致病性豬藍(lán)耳病毒實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒

英文名稱： Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】25T/盒 & 50T/盒

【預(yù)期用途】高致病性豬藍(lán)耳病毒實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒

豬藍(lán)耳病又名豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome，PRRS）,，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,，PRRSV）引起的豬的一種傳染病， 不同年齡,、 品種和性別的豬均能感染，以流產(chǎn),、死胎,、弱胎、木乃伊胎以及仔豬呼吸困難,、 敗血癥,、高死亡率等為主要特征。2006年迄今,，我國多個(gè)省份暴發(fā)的豬藍(lán)耳病被證實(shí)為豬藍(lán)耳病病毒（Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,，HP-PRRSV），與豬藍(lán)耳病病毒普通株相比,，病毒株具有更高毒力和致病性,，能引起更高的死亡率,。

本試劑盒利用實(shí)時(shí)熒光PCR原理,，定性檢測高致病性豬藍(lán)耳病病毒,，對(duì)高致病性豬藍(lán)耳病病毒的診斷及療效評(píng)估有重要指導(dǎo)意義。

【檢驗(yàn)原理】

本試劑盒針對(duì)高致病性豬藍(lán)耳病毒的高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物和探針,，在反應(yīng)體系中含高致病性豬藍(lán)耳病毒基因組模板的情況下,，PCR反應(yīng)得以進(jìn)行并釋放熒光信號(hào)。利用熒光定量PCR儀對(duì)PCR過程中相應(yīng)通道信號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測和輸出,，實(shí)現(xiàn)檢測結(jié)果的定性分析,。

【主要組成成份】高致病性豬藍(lán)耳病毒實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒

序號(hào)	組成	25T/盒	50T/盒
1	HP-PRRSV RT-PCR反應(yīng)液	375 μL×1管	750 μL×1管
2	HP-PRRSV逆轉(zhuǎn)錄酶	50 μL×1管	100 μL×1管
3	HP-PRRSV Taq酶	75 μL×1管	150 μL×1管
4	HP-PRRSV陽性對(duì)照	40 μL×1管	40 μL×1管
5	HP-PRRSV陰性對(duì)照	40 μL×1管	40 μL×1管
6	說明書	1份	1份

注：陰性對(duì)照為豬基因組DNA，陽性對(duì)照為失去活性的高致病性豬藍(lán)耳cDNA,。

【儲(chǔ)存條件及有效期】避光-20℃以下保存,，避免反復(fù)凍融，有效期12個(gè)月,。

【適用儀器】ABI 系列,、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列,、Roche LightCycler R480,、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列,、杭州博日系列等多通道實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。

【樣本要求】

1.血液或血清樣品：使用無菌注射液抽取樣品置于離心管中待檢,。

2.肺臟,、淋巴結(jié)和脾臟樣品：取樣本20 g，加少量滅菌PBS,，用無菌研磨器研磨至糊狀,，再用4倍體積的PBS稀釋成乳劑,，8000 rpm 4℃離心10 min，取上清待檢,。

3.應(yīng)避免標(biāo)本間交叉污染,。

4.樣本收集后可立即檢測；若不能立即檢測,，可置于2～8℃冷藏過夜保存,；如需長期保存，標(biāo)本應(yīng)凍存于-80℃以下,，避免反復(fù)凍融,。。

【檢驗(yàn)方法】

1. 試劑準(zhǔn)備（試劑準(zhǔn)備區(qū)）高致病性豬藍(lán)耳病毒實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒

（1）從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實(shí)驗(yàn)所需試劑,，充分融化混勻并瞬時(shí)離心以去除管壁附著液體,。

（2）核算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的反應(yīng)數(shù)（n），并根據(jù)如下表所示反應(yīng)體系計(jì)算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的各種試劑量,。

n =陰性對(duì)照數(shù)（1T）+陽性對(duì)照數(shù)（1T）+誤差預(yù)留量（1T）+樣本數(shù)

單反液配制表(每份)	RT-PCR反應(yīng)液	15.0 μL
	逆轉(zhuǎn)錄酶	2.0 μL
	Taq酶	3.0 μL

 (3)在無菌離心管中加入上述試劑,，充分混勻后瞬時(shí)離心。按照20μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應(yīng)管,。

2.樣本準(zhǔn)備（樣本處理區(qū)）

用QIAGEN,、Roche公司RNA提取試劑盒提取RNA，具體操作按照其試劑盒說明書操作,。

3.加樣

在上述制備好的PCR反應(yīng)樣本管中分別加入處理好的待測標(biāo)本RNA各5 μL,、終體積25 μL/管，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時(shí)低速離心,，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上,。陰性對(duì)照和陽性對(duì)照管則各加5 μL試劑盒自帶的陰性對(duì)照或陽性對(duì)照品，終體積為25 μL/管,，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時(shí)低速離心,，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。

4.PCR（PCR擴(kuò)增區(qū)）

（1）取樣本處理區(qū)準(zhǔn)備好的PCR反應(yīng)管,，放置在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀樣品槽相應(yīng)位置,，并記錄放置順序。

（2）按下表設(shè)置儀器核酸擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,。

高致病性豬藍(lán)耳病毒實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒

反應(yīng)體積	25μL	通道選擇	FAM通道采集高致病性豬藍(lán)耳病毒信號(hào)
PCR 反應(yīng) 條件	步驟	條件	循環(huán)數(shù)
	反轉(zhuǎn)錄	42℃：10分鐘（min）	1
	預(yù)變性	95℃：3分鐘（min）	1
	預(yù)擴(kuò)增	95℃：5秒（s）	5
		55℃：40秒（s）
	PCR擴(kuò)增	95℃：5秒（s）	40
		55℃：40秒（s） （此階段結(jié)束時(shí)采集熒光信號(hào)）

【參考值（參考范圍）】

1.試劑盒有效性判定：

（1）陽性對(duì)照：有典型S型擴(kuò)增曲線或Ct值≤35,。

（2）陰性對(duì)照：Ct值＞38或無Ct值，線形為直線或輕微斜線,，無指數(shù)增長期,。

2.標(biāo)本結(jié)果判定：

（1）陽性：標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值≤35或有明顯指數(shù)增長期。

（2）可疑：標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值在35～38范圍內(nèi),。此時(shí)應(yīng)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)檢測,，如重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Ct值仍在35～38范圍內(nèi),，有明顯指數(shù)增長期，則判定為陽性,，否則為陰性,。

（3）陰性：標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值＞38或無Ct值。

【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】

通道及檢測結(jié)果	標(biāo)本檢測結(jié)果解釋
FAM
陰性（－）	標(biāo)本中未檢出高致病性豬藍(lán)耳病毒RNA
陽性（＋）	標(biāo)本中檢測出高致病性豬藍(lán)耳病毒RNA

【檢驗(yàn)方法的局限性】

• 當(dāng)檢測樣本中被檢核酸濃度低于本試劑盒的低檢出*可能會(huì)發(fā)生假陰性的結(jié)果,。
• 被檢樣本在采集,、運(yùn)輸、儲(chǔ)存以及處理過程中操作方式不當(dāng)容易造成RNA降解而產(chǎn)生假陰性結(jié)果,。
• 樣本在采集,、運(yùn)輸、儲(chǔ)存以及處理過程中發(fā)生交叉污染,，則容易得到假陽性結(jié)果,。

【產(chǎn)品性能指標(biāo)】產(chǎn)品的低檢出限為10² Copies/mL，產(chǎn)品CV值≤5%,。

【注意事項(xiàng)】

• 整個(gè)檢測過程應(yīng)嚴(yán)格按照本說明書要求分別在試劑準(zhǔn)備區(qū),、樣本處理區(qū)和PCR擴(kuò)增區(qū)進(jìn)行操作，各區(qū)實(shí)驗(yàn)服,、儀器,、耗材應(yīng)獨(dú)立使用，不能混用,；實(shí)驗(yàn)用吸頭采用帶濾芯吸頭,；樣本處理區(qū)應(yīng)配有生物安全柜，樣本處理在生物安全柜中進(jìn)行操作,；三個(gè)區(qū)應(yīng)該配有紫外線殺菌裝置,。
• 為避免RNA降解，樣本處理過程應(yīng)在0-4℃條件下操作,，且完成實(shí)驗(yàn)后立即上機(jī)檢測,；樣本處理過程中使用的器具耗材應(yīng)經(jīng)過無核酶處理。
• 每次實(shí)驗(yàn)應(yīng)該設(shè)置陰,、陽性對(duì)照,。
• 試劑盒所有試劑在使用前應(yīng)該在常溫下充分融化混勻，并應(yīng)瞬時(shí)離心,。
• 試劑盒內(nèi)所配陰性和陽性對(duì)照在次使用前應(yīng)全部轉(zhuǎn)移至標(biāo)本準(zhǔn)備區(qū),，并單獨(dú)存放。
• 為防止熒光干擾,，應(yīng)避免裸手直接接觸PCR反應(yīng)管,，并應(yīng)避免在PCR反應(yīng)管上進(jìn)行任何標(biāo)記。
• 儀器擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)應(yīng)按照本說明書相關(guān)要求進(jìn)行設(shè)置；不同批號(hào)試劑不能混用,。
• ABI系列熒光定量PCR儀參數(shù)設(shè)置中不選ROX校正，淬滅基因選擇None,。
• 實(shí)驗(yàn)過程中產(chǎn)品的廢棄物應(yīng)該進(jìn)行無害化處理后方可丟棄,。