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初代細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)
閱讀:836 發(fā)布時(shí)間:2019-2-27初代培養(yǎng)或原代培養(yǎng),,可以用于:(1)從供體獲取組織后的培養(yǎng);(2)組織和細(xì)胞剛剛離體,,生物性狀尚未發(fā)生很大的變化,具有二倍體遺傳性狀,,在供體來(lái)源充分,、生物條件穩(wěn)定的情況下(年齡、性別),,在一定程度上能反映體內(nèi)狀態(tài),。
實(shí)驗(yàn)方法原理合成培養(yǎng)基胰蛋白酶消化培養(yǎng)法,能把組織塊分散成細(xì)胞團(tuán)或單個(gè)細(xì)胞,,便于細(xì)胞從培養(yǎng)液中攝取營(yíng)養(yǎng)和排出代謝產(chǎn)物,,細(xì)胞能較快地長(zhǎng)成單層。
本法尤適用于培養(yǎng)大量組織,,細(xì)胞產(chǎn)量高,;但用于經(jīng)常性小量培養(yǎng)工作稍顯繁瑣,無(wú)菌操作不良時(shí)且易污染,。
實(shí)驗(yàn)材料組織
試劑,、試劑盒Hanks培養(yǎng)液胰蛋白酶
儀器、耗材吸管平皿培養(yǎng)瓶燒杯攪拌器三角燒瓶不銹鋼篩眼科剪眼科鑷計(jì)數(shù)板
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 準(zhǔn)備
取各種已消毒的培養(yǎng)用品置于凈化臺(tái)面,,紫外線消毒20 分鐘,;
2. 布局
點(diǎn)燃酒精燈(或煤氣燈),安裝吸管帽(應(yīng)通過(guò)火焰),;
3. 處理組織
把組織塊置入燒杯中,,用Hanks液漂洗2~3 次,去除血污,;如懷疑組織可能污染,,可先置于含有青鏈霉素的混合液中30~60 分鐘;
4. 剪切
用眼科剪把組織塊切成2~3 毫米大小的塊(用手術(shù)刀割亦可),,以便于消化,;加入比組織塊總量多30~50 倍的胰蛋白酶液,然后一并倒入三角燒瓶中,,結(jié)扎瓶口或塞以膠塞,;
5. 消化
或用恒溫水浴,或置入37 ℃溫箱消化均可,,消化中每隔20 分鐘應(yīng)搖動(dòng)一次,,如用電磁恒溫?cái)嚢杵飨茫ㄏ捌恐行柚靡粺o(wú)菌攪棒);消化時(shí)間依組織塊的大小和組織的硬度而定,;
6. 分離
在消化過(guò)程中見(jiàn)消化液發(fā)混濁時(shí),,可用吸管吸出少許消化液在鏡下觀察,如組織已分散成細(xì)胞團(tuán)或單個(gè)細(xì)胞,,立即終止消化,,隨即通過(guò)適宜不銹鋼篩,,濾掉尚未充分消化開(kāi)的組織塊(必要時(shí)可繼續(xù)進(jìn)行消化);低速(500~1000 轉(zhuǎn)/分)離心消化液5 分鐘,,吸出上清,,加入適量含有血清的培養(yǎng)液(如有其它酶或EDTA 等消化,需用Hanks液洗脫一兩次后,,再加入培養(yǎng)液),;
7. 計(jì)數(shù)
用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),如細(xì)胞懸液細(xì)胞密度過(guò)大,,再補(bǔ)加培養(yǎng)液調(diào)整后,,分裝入培養(yǎng)瓶中;對(duì)大多數(shù)細(xì)胞來(lái)說(shuō),,pH 要求在7.2~7.4范圍,,培養(yǎng)液呈微紅色,如顏色偏黃,,說(shuō)膽液體變酸,,可用NaHCO3調(diào)整;
8. 培養(yǎng)
置入36.5 ℃溫箱培養(yǎng),;如用CO2溫箱培養(yǎng),,瓶口需用紗布棉塞或螺旋帽(松口)堵塞,紗布塞易生霉菌,,每次換液時(shí)需更換新塞,。
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注意事項(xiàng)
組織塊、胰蛋白酶,、培養(yǎng)液等易受紫外線傷害的物品,,在培養(yǎng)時(shí)再攜入操作野;如預(yù)先置入,,需用紙張覆蓋,,以免受射線影響;開(kāi)始工作前先洗手,、75%酒精擦拭手至肘部(工作時(shí)宜挽上袖口),。
其他
常用的初代培養(yǎng)有組織塊培養(yǎng)和分散細(xì)胞培養(yǎng)。組織塊培養(yǎng)是將剪碎的組織塊直接移植在培養(yǎng)瓶壁上,,加入培養(yǎng)基后進(jìn)行培養(yǎng),。分散細(xì)胞培養(yǎng)則是將組織塊用機(jī)械法或化學(xué)法使細(xì)胞分散。如欲從胎兒或新生兒的組織分離到活性的游離細(xì)胞,,經(jīng)典的方法是用蛋白水解酶(如胰蛋白酶和膠原酶)消化細(xì)胞間的結(jié)合物,,或用金屬離子螯合劑(如EDTA)除去細(xì)胞互相粘著所依賴的Ca2+,再經(jīng)機(jī)械輕度振蕩,使之成為單細(xì)胞,。
參考《組織培養(yǎng)和分子細(xì)胞學(xué)技術(shù)》北京出版社
實(shí)驗(yàn)材料組織
試劑,、試劑盒Hanks培養(yǎng)液胰蛋白酶NaHCO3
儀器、耗材吸管培養(yǎng)瓶燒杯眼科剪眼科鑷
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 剪切
把組織小塊(1cm3)置入小燒杯或青霉素小瓶中,,用Hanks液漂液二三次以去掉表面血污,,吸凈Hanks液,用眼科剪反復(fù)剪切成1mm3塊為止,;
2. 擺布
用彎頭吸管吸取若干小塊,置入培養(yǎng)瓶中,;用吸管彎頭把組織小塊擺布在培養(yǎng)瓶底上,,小塊相互距離以0.5 cm 為宜,每一25 ml培養(yǎng)瓶底可擺布20~30 塊,;
3. 輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶,,令瓶底向上;注意翻瓶時(shí)勿令組織小塊流動(dòng),,塞好瓶塞,,置36.5 ℃溫箱2 小時(shí)左右(勿超過(guò)4 小時(shí)),使小塊微干涸,;
4. 培養(yǎng)
從溫臬中取出培養(yǎng)瓶,,開(kāi)塞,46 度斜持培養(yǎng)瓶(瓶底仍向上),,向瓶底角部輕輕注入培養(yǎng)液小許,,然后緩緩再把培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)過(guò)來(lái),讓培養(yǎng)液慢慢覆蓋附于瓶底上的組織小塊(組織小塊附著尚不牢,,注意不要把組織塊沖走),;置溫箱中靜止培養(yǎng)。待細(xì)胞從組織塊游出數(shù)量增多后,,再補(bǔ)加培養(yǎng)液,。
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其他
一、評(píng)價(jià)
翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶的目的是為使組織塊微干涸,,以利附和免從瓶壁流失,,但時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng),超過(guò)三四小時(shí)以上可能對(duì)組織有不利影響,。
組織塊培養(yǎng)法操作簡(jiǎn)便,,順利情況下,組織小塊貼壁培養(yǎng)后24 小時(shí),,細(xì)胞即可從小塊邊緣向四周游出,,通過(guò)生長(zhǎng)增殖,終亦可連接成片,;原組織小塊可*散成細(xì)胞而消失,。如組織塊過(guò)大,,殘留小塊換液時(shí)棄掉或再置另瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。
組織塊通過(guò)反復(fù)剪切可能受一定損傷,,并非每塊組織都有生長(zhǎng)能力,,但只要有一部分能生長(zhǎng)往往即可形成單層。