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【產(chǎn)品名稱】

通用名稱：豬流感病毒H1N1亞型雙色實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒

英文名稱：Swine Influenza Virus H1N1 Detection Kit (Dual channels Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】 25T/盒 & 50T/盒

【預(yù)期用途】

本試劑盒利用實(shí)時(shí)熒光PCR原理,，定性檢測豬流感病毒，對豬流感病毒引起的流感及其并發(fā)癥的診斷及療效評估有重要指導(dǎo)意義,。

【檢驗(yàn)原理】豬流感病毒H1N1亞型雙色實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒

本試劑盒針對豬流感病毒H1N1的高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物和探針，在反應(yīng)體系中含豬流感病毒H1N1基因組模板的情況下，PCR反應(yīng)得以進(jìn)行并釋放熒光信號(hào),。利用熒光定量PCR儀對PCR過程中相應(yīng)通道信號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測和輸出，實(shí)現(xiàn)檢測結(jié)果的定性分析,。

【主要組成成份】

序號(hào)	組成	25T/盒	50T/盒
1	SIV-H1N1 RT-PCR反應(yīng)液	375 μL×1管	750 μL×1管
2	SIV-H1N1逆轉(zhuǎn)錄酶	50 μL×1管	100 μL×1管
3	SIV-H1N1 Taq酶	75 μL×1管	150 μL×1管
4	SIV-H1N1陽性對照	40 μL×1管	40 μL×1管
5	SIV-H1N1陰性對照	40 μL×1管	40 μL×1管
6	說明書	1份	1份

注：陰性對照為豬基因組DNA,，陽性對照為失去活性的SIV-H1N1病毒cDNA。

【儲(chǔ)存條件及有效期】避光-20℃以下保存,，避免反復(fù)凍融,，有效期12個(gè)月。

【適用儀器】ABI 系列,、Bio-Rad系列,、Agilent Stratagene MX系列 、Roche LightCycler R480,、Cepheid SmartCycler,、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀,。

【樣本要求】

1.取咽喉拭子和鼻拭子,，采集方法如下：

(1) 咽喉拭子，采取時(shí)要將拭子深入喉頭及上顎裂來回刮3次～5次,，取咽喉分泌液,；

(2) 鼻拭子，將拭子深入鼻腔及周圍圈沾取分泌液,；

(3) 將咽喉拭子和鼻拭子一起放入有 1.0 mL 生理鹽水的離心管中備用,；

(4) 理想情況下標(biāo)本應(yīng)使用頭部為合成纖維的拭子，用鋁或塑料做桿,。不推薦棉拭子和木桿,。

2.血液或血清樣品：使用無菌注射液抽取樣品置于離心管中待檢。

3.標(biāo)本采集管應(yīng)包含含有蛋白穩(wěn)定劑的病毒運(yùn)輸液,。

4.應(yīng)避免標(biāo)本間交叉污染,。豬流感病毒H1N1亞型雙色實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒

5.標(biāo)本收集后可立即檢測,；若不能立即檢測，可置于2～8℃冷藏過夜保存,；如需長期保存,，標(biāo)本應(yīng)凍存于-80℃以下，避免反復(fù)凍融,。

【檢驗(yàn)方法】

1. 試劑準(zhǔn)備（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

（1）從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實(shí)驗(yàn)所需試劑,，充分融化混勻并瞬時(shí)離心以去除管壁附著液體。

（2）核算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的反應(yīng)數(shù)（n）,，并根據(jù)如下表所示反應(yīng)體系計(jì)算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的各種試劑量,。

n =陰性對照數(shù)（1T）+陽性對照數(shù)（1T）+誤差預(yù)留量（1T）+樣本數(shù)

單反液配制表(每人份)	RT-PCR反應(yīng)液	15.0 μL
	逆轉(zhuǎn)錄酶	2.0 μL
	Taq酶	3.0 μL

 (3)在無菌離心管中加入上述試劑，充分混勻后瞬時(shí)離心,。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應(yīng)管,。

2.樣本準(zhǔn)備（樣本處理區(qū)）

用QIAGEN、Roche公司RNA提取試劑盒提取RNA,，具體操作按照其試劑盒說明書操作,。

3.加樣豬流感病毒H1N1亞型雙色實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒

在上述制備好的PCR反應(yīng)樣本管中分別加入處理好的待測標(biāo)本RNA各5 μl、終體積25 μl/管,，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時(shí)低速離心,，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。陰性對照和陽性對照管則各加5 μL試劑盒自帶的陰性對照或陽性對照品,，終體積為25 μl/管,，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時(shí)低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上,。

4. PCR（PCR擴(kuò)增區(qū)）

（1）取樣本處理區(qū)準(zhǔn)備好的PCR反應(yīng)管,，放置在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀樣品槽相應(yīng)位置，并記錄放置順序,。

（2）按下表設(shè)置儀器核酸擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,。

豬流感病毒H1N1亞型雙色實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒

反應(yīng)體積	25 μL	通道選擇	FAM通道采集SIV-H1病毒熒光信號(hào) HEX通道采集SIV-N1病毒熒光信號(hào)
PCR 反應(yīng) 條件	步驟	條件	循環(huán)數(shù)
	反轉(zhuǎn)錄	42℃：10分鐘（min）	1
	預(yù)變性	95℃：3分鐘（min）	1
	預(yù)擴(kuò)增	95℃：5秒（s）	5
		55℃：40秒（s）
	PCR擴(kuò)增	95℃：5秒（s）	40
		55℃：40秒（s） （此階段結(jié)束時(shí)采集熒光信號(hào)）

 

注：ABI系列熒光PCR儀在設(shè)置時(shí)不選ROX校正，設(shè)置淬滅基團(tuán)選擇None,。

【參考值（參考范圍）】

1.試劑盒有效性判定：

 （1）陽性對照：有典型S型擴(kuò)增曲線或Ct值≤35,。

 （2）陰性對照：Ct值＞38或無Ct值，線形為直線或輕微斜線,，無指數(shù)增長期。

2.標(biāo)本結(jié)果判定：

（1）陽性：標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值≤35或有明顯指數(shù)增長期,。

（2）可疑：標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值在35～38范圍內(nèi),。此時(shí)應(yīng)對標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)檢測，如重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Ct值仍在35～38范圍內(nèi),，有明顯指數(shù)增長期,，則判定為陽性,，否則為陰性。

（3）陰性：標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值＞38或無Ct值,。

【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】

通道及檢測結(jié)果		標(biāo)本檢測結(jié)果解釋
FAM	HEX
陽性（＋）	陽性（＋）	標(biāo)本中檢出豬流感病毒H1亞型,、豬流感病毒N1亞型RNA
陽性（＋）	陰性（－）	標(biāo)本中檢出豬流感病毒H1亞型RNA，未檢出豬流感病毒N1亞型RNA
陰性（－）	陽性（＋）	標(biāo)本中檢出豬流感病毒N1亞型RNA,，未檢出豬流感病毒H1亞型RNA
陰性（－）	陰性（－）	標(biāo)本中未檢出豬流感病毒H1亞型,、豬流感病毒N1亞型RNA

【檢驗(yàn)方法的局限性】

• 當(dāng)檢測樣本中被檢核酸濃度低于本試劑盒的低檢出*可能會(huì)發(fā)生假陰性的結(jié)果。
• 被檢樣本在采集,、運(yùn)輸,、儲(chǔ)存以及處理過程中操作方式不當(dāng)容易造成RNA降解而產(chǎn)生假陰性結(jié)果。
• 樣本在采集,、運(yùn)輸,、儲(chǔ)存以及處理過程中發(fā)生交叉污染，則容易得到假陽性結(jié)果,。

【產(chǎn)品性能指標(biāo)】 產(chǎn)品的低檢出限為10² Copies/mL,，產(chǎn)品CV值≤5%。

【注意事項(xiàng)】

• 整個(gè)檢測過程應(yīng)嚴(yán)格按照本說明書要求分別在試劑準(zhǔn)備區(qū),、樣本處理區(qū)和PCR擴(kuò)增區(qū)進(jìn)行操作,，各區(qū)實(shí)驗(yàn)服、儀器,、耗材應(yīng)獨(dú)立使用,，不能混用；實(shí)驗(yàn)用吸頭采用帶濾芯吸頭,；樣本處理區(qū)應(yīng)配有生物安全柜,，樣本處理在生物安全柜中進(jìn)行操作；三個(gè)區(qū)應(yīng)該配有紫外線殺菌裝置,。
• 為避免RNA降解,，樣本處理過程應(yīng)在0-4℃條件下操作，且完成實(shí)驗(yàn)后立即上機(jī)檢測,；樣本處理過程中使用的器具耗材應(yīng)經(jīng)過無核酶處理,。
• 每次實(shí)驗(yàn)應(yīng)該設(shè)置陰、陽性對照,。
• 試劑盒所有試劑在使用前應(yīng)該在常溫下充分融化混勻,，并應(yīng)瞬時(shí)離心。
• 試劑盒內(nèi)所配陰性和陽性對照在次使用前應(yīng)全部轉(zhuǎn)移至標(biāo)本準(zhǔn)備區(qū),，并單獨(dú)存放,。
• 為防止熒光干擾，應(yīng)避免裸手直接接觸PCR反應(yīng)管，并應(yīng)避免在PCR反應(yīng)管上進(jìn)行任何標(biāo)記,。
• 儀器擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)應(yīng)按照本說明書相關(guān)要求進(jìn)行設(shè)置,；不同批號(hào)試劑不能混用。
• ABI系列熒光定量PCR儀參數(shù)設(shè)置中不選ROX校正,，淬滅基因選擇None,。
• 實(shí)驗(yàn)過程中產(chǎn)品的廢棄物應(yīng)該進(jìn)行無害化處理后方可丟棄。豬流感病毒H1N1亞型雙色實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒