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staurosporine誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡
閱讀：1342 發(fā)布時間：2019-2-19Staurosporine是蛋白激酶C和其他大部分激酶（包括酪氨酸蛋白激酶）強(qiáng)有力的抑制劑,。通過阻斷磷酸二酯鍵從DNA轉(zhuǎn)移到活化的酪氨酸位點而直接抑制拓普異構(gòu)酶II的活性,。可用于誘導(dǎo)CHO細(xì)胞凋亡,。
實驗方法原理 Staurosporine是蛋白激酶C和其他大部分激酶（包括酪氨酸蛋白激酶）強(qiáng)有力的抑制劑,。通過阻斷磷酸二酯鍵從DNA轉(zhuǎn)移到活化的酪氨酸位點而直接抑制拓普異構(gòu)酶II的活性,。可用于誘導(dǎo)CHO細(xì)胞凋亡,。
實驗材料 妊娠的C57BL 6cr小鼠
試劑,、試劑盒 staurosporine蒸餾水脫氫酶ZVAD-fmkLDH試劑盒Caspase3試劑盒膠原酶Ⅱ醌氯化鋇細(xì)胞計數(shù)試劑盒STSTrypsinEDTA DIDSNPPB
儀器、耗材 顯微鏡試管離心管移液槍離心管盒冰盒冰箱培養(yǎng)箱離心機(jī)載玻片蓋玻片
實驗步驟
一,、原代心肌細(xì)胞的培養(yǎng)及實驗方案
1. 取出生后0~24 h C57BL/6cr小鼠心臟,，按改良的Lader方法進(jìn)行細(xì)胞的分離。 獲取博動的心臟迅速放置于無Ca2+,、Mg2+的Hank’s平衡液中,。
2. 剪碎心臟，放置在4℃條件下100 g/L的Trypsin溶液中消化16~18 h,，用Trypsin抑制劑中止消化,。
3. 然后在37℃下，用膠原酶Ⅱ于CO2培養(yǎng)箱內(nèi),，在搖床上繼續(xù)孵化消化45~60 min,。
4. 后用70 μm直徑尼龍過濾網(wǎng)過濾獲取心肌細(xì)胞，用含有25 mmol/LHCO3-,，100 mL/L FSB,，1×105 u/L青霉素G和50 g/L鏈霉素的M199培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，按差速貼壁分離法純化心肌細(xì)胞。
5. 加入10 μmol/L BrdU到細(xì)胞懸液,，以6×105密度種植于96或24孔細(xì)胞培養(yǎng)板上,，置37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
6. 培養(yǎng)的心肌細(xì)胞24 h后更換含有10 μmol/L BrdU新鮮M199培養(yǎng)基,，培養(yǎng)72 h后進(jìn)行實驗使用。
7. 設(shè)立陰性,、陽性對照及實驗組,，每組20孔；陽性對照加入4 μmol/L STS,，實驗組中加入4 μmol/L STS后再分別加入250 μmol/L DIDS或100 μmol/L NPPB,，100 μmol/L Quinine和1 mmol/L BaCl2孵化4 h，更換新鮮M199培養(yǎng)基繼續(xù)孵化4 h后進(jìn)行各種指標(biāo)的檢測,。
二,、細(xì)胞存活試驗
1. 按照實驗方案處理后的培養(yǎng)心肌細(xì)胞，每100 μL培養(yǎng)基的小孔中加入10 μL的MTT再孵化2 h,，用分光比色儀進(jìn)行檢測,，實驗結(jié)果以細(xì)胞存活率表示，細(xì)胞存活率=A試驗組/A對照組×100%。MTT法A值既能反映心肌細(xì)胞內(nèi)線粒體脫氫酶活性,，又能間接反映心肌細(xì)胞的增殖與存活情況,。
三、凋亡瓊脂糖凝膠電泳檢測
1. 收集24孔板處理過的細(xì)胞,，棄上清加入50 μL含有200 mg/L的RNase細(xì)胞裂解液(10 μmol/L Tris·HCl,，0.1 mol/L EDTA，5 g/L SDS),，37℃孵化1 h再加入500 mg/L蛋白酶K繼續(xù)孵化,。
2. 1 h后加入等體積的酚、異丙醇（25∶24∶1）充分搖勻,，離心取上清再加入等體積的抽提1次,，轉(zhuǎn)移的上清液中再加1/10體積3 mol/L醋酸鈉及兩倍體積的無水乙醇過夜后離心，700 mL/L的乙醇洗滌后,，TE液溶解DNA,，于20 g/L含有溴化乙錠的瓊脂糖凝膠中電泳，紫外透射儀下觀察,、記錄拍照,。
三、Caspase3活性的檢測
使用ApoONETM Homogeneous Caspase3試劑盒檢測Caspase3活性,。實驗設(shè)立空白,、陰性對照及實驗組，含有100 μL培養(yǎng)基的實驗細(xì)胞中,，加入100 μL的混合Caspase3底物ZDEVDR110和緩沖液,，在室溫下輕微搖動孵化6~8 h，用熒光檢測儀于激發(fā)波為485 nm,，散發(fā)波長538 nm處,，讀取檢測熒光值.
四、心肌細(xì)胞膜完整性檢測
細(xì)胞培養(yǎng)上清乳酸脫氫酶（LDH）活性檢測,，LDH能催化乳酸生成丙酮酸,，丙酮酸與2，4二硝基苯肼反應(yīng)生成丙酮酸二硝基苯腙,，在堿性溶液中呈棕紅色,，通過比色可求出酶活力。取細(xì)胞培養(yǎng)上清50 μL,，反應(yīng)后490 nm處測A值,。
收起
注意事項
1. 嚴(yán)格進(jìn)行消毒．使用三套器械取材。
2. 嚴(yán)格進(jìn)行無菌操作,，防止細(xì)菌,、真菌,、支原體污染，避免化學(xué)物質(zhì)污染,。
3. 吸取液體前，瓶口和吸管進(jìn)行火焰消毒,；經(jīng)火焰消毒后的吸管一定要用Hank’S液冷卻,。防止?fàn)C傷、燙死細(xì)胞,。吸取液體時,，避免瓶口和吸管接觸碰撞。
4. 離心管入臺前,，管口,、管壁應(yīng)消毒。