化工儀器網(wǎng)
技術(shù)文章
大鼠肝星狀細(xì)胞原代培養(yǎng)實驗
閱讀：499 發(fā)布時間：2019-2-13實驗方法原理將小鼠的肝細(xì)胞從機體中取出,，經(jīng)胰酶,、螯合劑（常用EDTA）處理，分散成單細(xì)胞,，置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng),，使細(xì)胞得以生存、生長和繁殖,。
實驗材料SD大鼠
試劑,、試劑盒小牛血清DMEM酶消化液D-Hanks' 液酚紅臺盼蘭HBSS氯化鈉PBS
儀器、耗材手術(shù)刀手術(shù)剪尼龍網(wǎng)相差顯微鏡熒光顯微鏡
實驗步驟
一,、實驗材料準(zhǔn)備
1. 動物：雄性SD大鼠(體重250-450 g),。
2. 試劑：，小牛血清(或胎牛血清,，則更好),，DMEM，酶消化液I,、Ⅱ(以HBSS配),，18% Nycodenz(以GBSS配)，D-Hanks' 液(KCl 0.4 g/L,，KH2PO4 0.06 g/L,，NaCl 8.0 g/L,，NaHCO3 0.35 g/L，Na2HPO4·7H2O 0.06 g/L或Na2HPO4 0.053 g/L,，可加酚紅 0.02 g/L),，HBSS，臺盼蘭等,。
3. 器械：手術(shù)器械,，200目尼龍網(wǎng)，相差顯微鏡,，熒光顯微鏡。
二,、原代培養(yǎng)方法
1. 大鼠腹腔麻醉后在超凈臺上剖腹,，進(jìn)行門靜脈插管，以D-Hanks'液灌注,，同時剪開下腔靜脈,，沖掉血液后，改灌以100 ml酶消化液I(0.05% IV型膠原酶),。
2. 待肝臟變軟后,，離體肝臟并剪碎，繼續(xù)以酶消化液II(含20 U/ml DNase I的0.05% IV型膠原酶)消化15 min,，尼龍網(wǎng)過濾后以450 g 離心5 min(4℃,，下同)。
3. 以HBSS重懸沉淀至10 ml,，再混以20 ml Nycodenz液,，分置于離心管中，并分別覆以2-3 ml HBSS,，1450 g離心16 min后取界面細(xì)胞,。
4. 以HBSS重懸后再次離心收集細(xì)胞，以DMEM重懸后進(jìn)行細(xì)胞計數(shù),，并判斷存活率和產(chǎn)量,，后按照常規(guī)方法接種(105細(xì)胞/cm2)，次日換液,，以后每2-3天換液一次,。
三、傳代方法
棄去培液后以D-Hanks'液洗兩次,，加0.125%胰酶(原代加0.05% EDTA)消化,，鏡下觀察細(xì)胞突起回縮(2-5 min左右)，以*培液(DMEM+10% NBS)終止反應(yīng)(若不用EDTA,，可以不需離心),，充分吹打后以1:2-1:3接種,，然后繼續(xù)培養(yǎng)(5%CO2，37℃),。
四,、 結(jié)果
接種次日，光鏡下可見細(xì)胞呈星芒狀,，胞質(zhì)內(nèi)有脂滴,，熒光鏡下328 nm處見自發(fā)熒光。附上發(fā)表于Biochem Biophys Res Commun 2004年文章的照片(圖1),。
注意事項
1. 進(jìn)一步鑒別需要做免疫組化：Desmin和α-SMA,；后者在細(xì)胞激活后才表達(dá)。
2. 采用無須原位消化的方案,，*可行,，只不過消化時間更難控制！實驗采用原代培養(yǎng)的或傳代后9代內(nèi)的細(xì)胞(5代以內(nèi)),。
其他
一,、參考文獻(xiàn)
1. 袁桃霞，張錦生,，張月娥,，等. 大鼠肝Ito細(xì)胞的體外培養(yǎng)及肝素對其抑制作用的觀察. 上海醫(yī)科大學(xué)學(xué)報 1996;23(2):90-93.
2. Huang GC, Zhang JS, Tang QQ. Involvement of C/EBP-α gene in in vitro activation of rat hepatic stellate cells. Biochem Biophys Res Commun 2004;324(4):1309-1318.