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人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)與增殖實(shí)驗(yàn)
閱讀：848 發(fā)布時(shí)間：2019-1-25血管內(nèi)皮細(xì)胞不僅參與調(diào)節(jié)血管通透性和凝血過(guò)程,，在免疫調(diào)節(jié)，移植排斥,，腫瘤轉(zhuǎn)移,，炎癥等許多過(guò)程中也具有重要作用。內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)是體外研究?jī)?nèi)皮細(xì)胞功能的重要手段,。70年代Eric等建立了內(nèi)皮細(xì)胞分離及體外培養(yǎng)的方法,。實(shí)驗(yàn)方法原理 在體外,，內(nèi)皮細(xì)胞在內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子存在的條件下可迅速增殖,，并可傳代，可作為內(nèi)皮細(xì)胞增殖,，細(xì)胞因子分泌,、表型等研究的模型。
實(shí)驗(yàn)材料 膠原酶血清
試劑,、試劑盒 Cord Buffor硫酸鏈霉素生埋鹽水EDTA-Na明膠
儀器,、耗材 插管止血鉗注射器手套絲線(xiàn)飯盒勻漿機(jī)離心機(jī)振蕩器培養(yǎng)瓶CO孵箱顯微鏡超凈工作臺(tái)孔板
實(shí)驗(yàn)步驟
一,、臍帶內(nèi)皮細(xì)胞的分離
1. 臍帶收集
用無(wú)菌止血鉗夾閉臍帶兩端，在止血鉗外側(cè)剪斷臍帶,，放入盛有4 ℃Cord Buffer的飯盒內(nèi),。臍帶在4 ℃放置不應(yīng)超過(guò)24 小時(shí)。
2. 臍帶內(nèi)皮細(xì)胞分離
（1）帶無(wú)菌手套,，取出臍帶,，在止血鉗內(nèi)側(cè)用碘酒和酒精棉球消毒后，用無(wú)菌剪刀將兩端臍帶剪除,。
（2）在臍帶一端找到靜脈,，插入臍帶靜脈插管，用2 根粗絲線(xiàn)扎牢,，用Cord Buffer抽吸有的30 ml注射器沖洗靜脈腔,，至將臍血洗凈。
（3）趕出靜脈腔內(nèi)殘余液體,，將臍帶另一端用止血鉗夾閉,，用10 ml注射器連接針頭，注入37 ℃預(yù)熱的0.1 ％膠原酶約6-8 ml,，放入37 ℃ Cord Buffer中保溫6-10 min,。
（4）吸出靜脈腔內(nèi)膠原酶所消化的細(xì)胞懸液，加入預(yù)加有20 ml Cord Buffer的離心管中,，沖洗靜脈腔,，一并加入離心管中。
（5）離心,，1500 rpm,，10 min棄上清，用5～7 ml 20 ％FCS,，RPMT 1640重懸細(xì)胞,，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶，放5 ％CO孵箱,。
二,、牛下丘腦內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子粗提物的制備
1. 取新鮮牛下丘腦，加1.5倍體積的冰生理鹽水用組織勻漿機(jī)勻漿,，每次0.5 min,，共6次。
2. 在4 ℃條件下用震蕩器機(jī)械震蕩約1.5 h,。
3. 離心,，10000 g，40 min,，收取上清液,。
4. 按0.5 ％加硫酸鏈霉素,，4 ℃過(guò)夜。
5. 離心,，20000 g,，40 min，收取上清液,。
6. 用紫外分光光度測(cè)280 nm,，260 nm OD值按公式計(jì)算蛋白含量。
7. 過(guò)濾,，分裝,，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?nbsp;
三、內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)與鑒定
1. 培養(yǎng)瓶包被明膠
培養(yǎng)瓶（25 cm）中加入0.2 ％明膠3 ml,，使其鋪滿(mǎn)瓶底,，放4 ℃?zhèn)溆谩Ｓ们皸壢ッ髂z溶液,。
2. 原代培養(yǎng)
將從臍帶靜脈中收集到的內(nèi)皮細(xì)胞移入包被明膠的培養(yǎng)瓶（25 cm）,，加5～7 ml 20 ％小牛血清199培養(yǎng)基，按終濃度分別為20 μg/ml和100 μg/ml加入內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子粗提物和肝素,。每3～4 天換液1 次,。
3. 傳代培養(yǎng)
待內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)鋪滿(mǎn)瓶底后即可傳代。吸去培養(yǎng)基,，用無(wú)血清RPMI1640 2 ml洗培養(yǎng)瓶1 次,。加入0.1 ％胰酶、0.02 ％EDTA-Na 3 ml,，放37 ℃孵箱,。待鏡下見(jiàn)大多數(shù)細(xì)胞卷縮變圓，可加入含血清培養(yǎng)基3 ml,，以終止胰酶的消化作用,，用彎頭滴管吹打。收取細(xì)胞懸液,，加入離心管中,，離心1500 rpm，10 min,。棄上清,，以*培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，移入培養(yǎng)瓶擴(kuò)大培養(yǎng),。
4. 內(nèi)皮細(xì)胞鑒定
光鏡下內(nèi)皮細(xì)胞為多角形或梭形,，可見(jiàn)1～2 個(gè)清晰的細(xì)胞核,。透射電鏡下,， 部分內(nèi)皮細(xì)胞中可有特征性的Weible-Palade小體存在,。間接免疫熒光染色，內(nèi)皮細(xì)胞為ⅧR∶Ag陽(yáng)性,。
四,、牛下丘腦內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子粗提物活性的測(cè)定
1. 0.1 ％胰酶0.02 ％EDTA消化收獲內(nèi)皮細(xì)胞，計(jì)數(shù),，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至5×104 /ml,。
2. 細(xì)胞懸液加入包被明膠的96孔板，每孔100 μl,，5×103個(gè)細(xì)胞,。
3. 放置于5 ％CO孵箱，24 h,，待細(xì)胞全部貼壁生長(zhǎng),。
4. 每孔加待檢樣品100 μl，每個(gè)稀釋度設(shè)3個(gè)復(fù)孔,，并設(shè)培養(yǎng)基陰性對(duì)照,。
5. 放5 ％CO孵育，48～72 h,，待陰性對(duì)照與陽(yáng)性有明顯差別時(shí),，加3HTdR，每孔0.5 μci/50 μl,。
6. 放5 ％CO孵箱,，繼續(xù)培養(yǎng)12 h。
7. 細(xì)胞收集儀收集細(xì)胞,，檢測(cè)Cpm值可計(jì)算刺激指數(shù),。
收起
注意事項(xiàng)
1. 嚴(yán)格無(wú)菌操作，防止在分離,、培養(yǎng)和傳代內(nèi)皮細(xì)胞過(guò)程中發(fā)生污染,。
2. 膠原酶消化時(shí)所需濃度，時(shí)向要進(jìn)行預(yù)試,。如膠原酶濃度過(guò)高,，內(nèi)皮細(xì)胞容易死亡；濃度過(guò)低,，則細(xì)胞收獲量低,。
3. 內(nèi)皮細(xì)胞應(yīng)進(jìn)行鑒定，以防將成纖維細(xì)胞誤認(rèn)為內(nèi)皮細(xì)胞,。