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人腫瘤抗原的識別與鑒定實驗
閱讀：338 發(fā)布時間：2019-1-22實驗方法原理
本實驗用Dynabeads protein A 進行免疫復(fù)合物的純化,。Dynabeads A 蛋白 （Dynabeads Protein A） 在免疫沉淀中有以下作用：
（1）將方案時間減少到 30 分鐘,。
（2）顯著降低非特異性結(jié)合造成的背景
（3）保持蛋白質(zhì)復(fù)合物的完整,。對珍貴的蛋白質(zhì)沒有物理壓力,。
實驗材料 腫瘤細胞
試劑,、試劑盒 PBS生理鹽水裂解液蛋白酶抑制劑
儀器、耗材 培養(yǎng)瓶細胞刮棒離心管低溫離心機-80℃冰箱探針型超聲波恒溫水浴鍋
實驗步驟
一,、 裂解細胞
1. 方向刮取細胞,。將細胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管，離心取沉淀,，-80℃ 保存,。（收集細胞要迅速，低溫下進行,，以減弱蛋白酶的作用）
2. 裂解細胞,。采用RIPA 裂解體系，使用前40℃ 預(yù)冷,，按107 個細胞加入1.0 ml 裂解液,，吹打混勻，加入適量的蛋白酶抑制劑
（如cocktail）,， 冰上放置3~5 分鐘,。
3. 超聲處理裂解液。使用探針型超聲進行多次適當頻率的短促沖擊,，10~20秒/次,，重復(fù)3 次，中間間隔10~20 秒,，冰浴下進行,。
4. 15 000 rpm,，40℃離心15 min，吸取上清液于另一EP管中,，置冰上,。上清液用于下一步的預(yù)處理。
二,、裂解物的預(yù)處理
使用正常人的血清對裂解物進行預(yù)處理,。
1. 按1 ml 裂解物加2 ul 對照血清的比例加入正常人血清。
2. 室溫孵育2~3 小時,，緩慢搖動,。
三、免疫復(fù)合物的純化
1. 用Dynabeads protein A 進行免疫復(fù)合物的純化,。
2. 將Dynabeads protein A 振蕩混勻,，吸取100 ul 磁珠于EP 管中，置于磁鐵架（Dynal MPC）上,，磁珠吸附到管壁上,，棄上清。
3. 加500 ul 0.1 M Na-phosphate (pH8.1 )至Ep 管,，輕柔搓動管子約2~3 min,，將EP管置于磁鐵架上，磁珠吸附到管壁上,，棄上清,。
4. 重復(fù)2 步驟兩次。
5. 清洗完磁珠后,，加500 ul 預(yù)處理后的裂解物,，反復(fù)搖動管子，室溫下反應(yīng)10~20 min,。
6. 將EP管置于磁鐵架上,，磁珠吸附到管壁上，將上清轉(zhuǎn)移至另一EP管中,。
7. 用RIPA 裂解液清洗磁珠3 次,。
8. 洗脫抗原-抗體復(fù)合物。加0.1 M citrate (pH3.1) 30 ul于Ep 管中,，輕柔搓動管子約2~3 min,，將P管置于磁鐵架上，吸取上清于一EP管,。
9. 重復(fù)步驟7,，將上清收集于同一個EP管洗脫樣品總體積為60 ul，作對照用。
10. 磁珠用0.1 M Na-phosphate (pH8.1 ) 清洗三次后備用,。
11. 在步驟5 留取的上清中加入病人血清（1 ml 加2 ul 血清）,，緩慢搖動，室溫孵育2~3 h,。
12. 將EP管置于磁鐵架上，磁珠吸附到管壁上,，棄上清,。
13. 重復(fù)步驟6~8。共收集到兩份樣品,，對照與病人的純化免疫復(fù)合物各60 ul,。
14. 磁珠用0.1 M Na-phosphate (pH8.1 ) 清洗三次后加入柱儲液100 ul，40℃ 保存,。
15. 在樣品中加入2xSDS 上樣緩沖液并用1 M NaOH 調(diào)節(jié)pH 至使溴酚藍呈藍色,。
四、結(jié)果分析
1. 1D SDS-PAGE用免疫沉淀后的樣品可直接進行一維凝膠電泳,，或者對磁珠上的蛋白A 或蛋白G 進行耦聯(lián)劑修飾,，洗脫后的樣品可進行Western Blot。
2. RIPA裂解液：
150 mmol/L NaCl,；1.0%NP-40,；0.5%脫氧膽酸鈉； 0.1%SDS ,；50 mmol/L Tris（ pH8.0）,。
收起
注意事項
為了避免抗體的共洗脫，在繼續(xù)進行免疫沉淀之前,，應(yīng)該將抗體交聯(lián)到免疫磁珠,建議使用交聯(lián)劑,。
其他
Dynabeads protein A 捕獲的 Ig 量取決于起始樣品中 Ig 的濃度。 100 µl Dynabeads A 蛋白可從含有 20- 200 µg IgG ⁄ml 的樣品中分離約 25- 30 µg 人 IgG,。 絕大部分位點與 Fc 結(jié)合,，實現(xiàn)的 Ig 取向。