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大鼠肺成纖維細(xì)胞原代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)
閱讀：491 發(fā)布時(shí)間：2019-1-10實(shí)驗(yàn)方法原理
將大鼠的肺成纖維細(xì)胞從機(jī)體中取出,，經(jīng)胰酶,、螯合劑（常用EDTA）處理,，分散成單細(xì)胞,，置合適的生長培養(yǎng)基培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞得以生存,、生長和繁殖,。
實(shí)驗(yàn)材料 Wistar乳鼠
試劑、試劑盒 PBS牛血清青霉素鏈霉素EDTA胰酶碘酒酒精
儀器,、耗材 綿球科直剪眼科彎剪眼科直鑷眼科彎鑷玻璃平皿塑料培養(yǎng)瓶
實(shí)驗(yàn)步驟
一,、實(shí)驗(yàn)材料準(zhǔn)備
1. 動物
出生后1-4天的Wistar乳鼠1只,。
2. 試劑
PBS、培養(yǎng)液(Hyclone的低糖DMEM,，含Hyclone的10%新生牛血清,、100 U/ml 青鏈霉素、1%明膠PBS,、0.25%胰酶(含EDTA,，GIBCO)，碘酒和酒精綿球,。
3. 器械
眼科直剪2把,、眼科彎剪2把、眼科直鑷2把,、眼科彎鑷2把,、玻璃平皿3套，25 cm2塑料培養(yǎng)瓶(Costar),。
二,、具體操作
1. 明膠包被培養(yǎng)瓶過夜(準(zhǔn)備2-3個)，取出明膠,，用2 ml培養(yǎng)液沖洗培養(yǎng)瓶一遍,，置于超凈臺中。
2. 解剖取肺：將乳鼠在酒精中浸泡后取出,，轉(zhuǎn)移至超凈臺上的玻璃培養(yǎng)皿中,，用碘酒消毒胸部皮膚，再用酒精棉球脫碘,。左手捏緊乳鼠頸背部皮膚以充分展露胸部,，右手以眼科直剪剪開皮膚，充分撕拉開,，再用酒精棉球消毒,，繼而以另一把眼科彎剪沿胸骨柄左下緣向上剪開肋骨，然后在切口中間橫剪胸骨,。用眼科鑷取出肺,，置于盛有PBS(含有200 U/ml青鏈霉素)的玻璃平皿中，沖洗去血,。
3. 用眼科剪將肺分成幾個肺葉,，用鑷子去除周邊的血凝塊及纖維組織，用眼科剪剪去肺門處的支氣管和血管,，再用含有雙抗的PBS沖洗1遍,。
4. 用眼科彎剪將肺組織剪碎成1 mm3大小，加入含有雙抗的PBS,，將肺組織塊吹打開,，靜置15 min后,，更換新的PBS。
5. 用200 ul微量加樣器(超凈臺中的,，臨用時(shí)用酒精綿球好好擦拭槍柄)取200 ul加樣槍頭一個,，剪去尖，在酒精燈上用火焰燒彎,。用槍頭吸取組織塊接種于培養(yǎng)瓶中,，每瓶20-25塊左右，每小塊間距0.5 cm左右,。組織塊放置好后,，輕輕將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)，讓瓶底朝上,，向瓶內(nèi)加入2 ml左右的培養(yǎng)液,，蓋好瓶蓋，將培養(yǎng)瓶傾斜放置在溫箱中,，干貼壁2-4 h后,，將培養(yǎng)瓶慢慢翻轉(zhuǎn)平放，繼續(xù)靜置培養(yǎng),。注意上述操作過程中動作要輕柔,，讓液體慢慢覆蓋組織小塊，嚴(yán)禁動作過快致使液體產(chǎn)生的沖力使粘貼的組織塊漂起而造成原代培養(yǎng)失敗,。48 h后換液,，更換2-3 ml即可。
6. 貼塊貼壁72 h后,，鏡下可見大量的成纖維細(xì)胞爬出,，將組織塊去除，繼續(xù)培養(yǎng)2-3天,，待細(xì)胞長滿，即可傳代,。注：因?yàn)檠鍧舛鹊?，?nèi)皮細(xì)胞可以爬出少量，但是很快就會死掉,。
2.7 傳代用0.25%胰酶常規(guī)消化,，以1:2傳代，傳代完后,，采用差速貼壁法純化一次,，即待細(xì)胞貼壁1.0 -1.5 h后(即絕大多數(shù)成纖維細(xì)胞都已經(jīng)貼壁)，棄去未貼壁的細(xì)胞和培養(yǎng)液,，更換新的培養(yǎng)液,。
成纖維細(xì)胞為長梭形形態(tài),，常呈漩渦狀生長。見下圖：
收起
注意事項(xiàng)
1.要注意無菌操作,。
2.操作過程中動作要輕柔,，讓液體慢慢覆蓋組織小塊，嚴(yán)禁動作過快致使液體產(chǎn)生的沖力使粘貼的組織塊漂起而造成原代培養(yǎng)失敗,。
肺成纖維細(xì)胞能分泌多種細(xì)胞因子和其他物質(zhì),，并與肺內(nèi)其他細(xì)胞有著密切的相互作用，從而在支氣管哮喘,、慢性阻塞性肺疾病,、肺纖維化等疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。體外培養(yǎng)肺成纖維細(xì)胞是研究肺部疾病如支氣管哮喘,、慢性阻塞性肺疾病,、肺纖維化等的重要手段和工具。
其他
肺成纖維細(xì)胞能分泌多種細(xì)胞因子和其他物質(zhì),，并與肺內(nèi)其他細(xì)胞有著密切的相互作用,，從而在支氣管哮喘、慢性阻塞性肺疾病,、肺纖維化等疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用,。體外培養(yǎng)肺成纖維細(xì)胞是研究肺部疾病如支氣管哮喘、慢性阻塞性肺疾病,、肺纖維化等的重要手段和工具,。