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實(shí)驗(yàn)方法原理

基本原理類似于DNA的天然復(fù)制過程,，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。

 

PCR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：

 

①模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右一定時(shí)間后,，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離,，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合,，為下輪反應(yīng)做準(zhǔn)備,；

 

②模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右,，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對結(jié)合,；

 

③引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在Taq酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料,，靶序列為模板,，按堿基配對與半保留復(fù)制原理,，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈。

 

重復(fù)循環(huán)變性--退火--延伸三過程,，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”,，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2～4分鐘,， 2～3小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬倍,。

 

實(shí)驗(yàn)材料模板DNA

試劑、試劑盒dNTPTaq DNA聚合酶蒸餾水PCR緩沖液引物氯化鎂

儀器,、耗材PCR儀移液槍PCR板薄壁管離心管離心管盒

實(shí)驗(yàn)步驟

一,、標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)體系

 

10×擴(kuò)增緩沖液 　   10 ul

 

 

4種dNTP混合物 　 各200 umol/L

 

 

引物 　　　　 　     各10～100 pmol

 

 

模板DNA 　　　 　0.1～2 ug

 

 

Taq DNA聚合酶 　  2.5 u

 

 

Mg2+　　　　　　 1.5 mmol/L

 

 

加雙或三蒸水至 　  100 ul

 

 

二、PCR引物設(shè)計(jì)

 

PCR反應(yīng)中有兩條引物,，即5′端引物和3′引物,。設(shè)計(jì)引物時(shí)以一條DNA單鏈為基準(zhǔn)（常以信息鏈為基準(zhǔn)），5′端引物與位于待擴(kuò)增片段5′端上的一小段DNA序列相同,；3′端引物與位于待擴(kuò)增片段3′端的一小段DNA序列互補(bǔ),。

 

1.   引物設(shè)計(jì)的基本原則

 

（1）  引物長度：15-30 bp，常用為20 bp左右,。

 

（2） 引物堿基：G+C含量以40-60%為宜,，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C 過多易出現(xiàn)非特異條帶,。ATGC隨機(jī)分布,，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

 

 

（3） 引物內(nèi)部不應(yīng)出現(xiàn)互補(bǔ)序列,。

 

 

（4）兩個(gè)引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列,，尤其是避免3 ′端的互補(bǔ)重疊。

 

 

（5） 引物與非特異擴(kuò)增區(qū)的序列的同源性不要超過70%,，引物3′末端連續(xù)8個(gè)堿基在待擴(kuò)增區(qū)以外不能有*互補(bǔ)序列,，否則易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。

 

 

（6）引物3‘端的堿基,，特別是末及倒數(shù)第二個(gè)堿基,，應(yīng)嚴(yán)格要求配對，選擇是G和C,。

 

 

（7） 引物的5 ′端可以修飾,。如附加限制酶位點(diǎn)，引入突變位點(diǎn),，用生物素,、熒光物質(zhì)、標(biāo)記,，加入其它短序列,，包括起始密碼子,、終止密碼子等。

 

 

2.   引物設(shè)計(jì)軟件

 

Primer Premier5.0 （自動(dòng)搜索）*,、Oligo6 （引物評價(jià)）,、Vector NTI Suit、DNAsis,、Omiga,、DNAstar、Primer3 （在線服務(wù)）,。

 

三,、模板的制備

 

（1）PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA,。

 

（2）模板的取材主要依據(jù)PCR的擴(kuò)增對象,，可以是病原體標(biāo)本如病毒、細(xì)菌,、真菌等,。也可以是病理生理標(biāo)本如細(xì)胞、血液,、羊水細(xì)胞等,。法醫(yī)學(xué)標(biāo)本有血斑、精斑,、毛發(fā)等,。

 

（3）標(biāo)本處理的基本要求是除去雜質(zhì)，并部分純化標(biāo)本中的核酸,。多數(shù)樣品需要經(jīng)過SDS和蛋白酶K處理,。難以破碎的細(xì)菌，可用溶菌酶加EDTA處理,。所得到的粗制DNA,，經(jīng)酚,、抽提純化,，再用乙醇沉淀后用作PCR反應(yīng)模板。

 

四,、PCR反應(yīng)條件的控制

 

1.  PCR反應(yīng)的緩沖液提供合適的酸堿度與某些離子 ,。 

 

2.  鎂離子濃度總量應(yīng)比dNTPs的濃度高，常用1.5 mmol/L,。

 

　　

3.  底物濃度dNTP以等摩爾濃度配制,，20～200 umol/L。

 

　

4.  TaqDNA聚合酶2.5U(100 ul）,。

 

　　

5.  引物 濃度一般為0.1 ～0.5 umol/L,。

 

　

6.  反應(yīng)溫度

 

 

（1）變性溫度和時(shí)間95℃,，30 s。

 

 

（2）退火溫度和時(shí)間 低于引物Tm值5 ℃左右,，一般在45～55℃,。

 

 

（3）延伸溫度和時(shí)間72℃，1 min/kb(10 kb內(nèi)）,。

 

 

（4）Tm值=4(G+C) +2(A+T)

 

7.  循環(huán)次數(shù) ：一般為25 ～30次,。循環(huán)數(shù)決定PCR擴(kuò)增的產(chǎn)量。模板初始濃度低,，可增加循環(huán)數(shù)以便達(dá)到有效的 擴(kuò)增量,。但循環(huán)數(shù)并不是可以無限增加的。一般循環(huán)數(shù)為30個(gè)左右,，循環(huán)數(shù)超過30個(gè)以后,，DNA聚合酶活性逐漸達(dá)到飽和，產(chǎn)物的量不再隨循環(huán)數(shù)的增加而增加,，出現(xiàn)了所謂的“平臺(tái)期”,。

 

 

五、PCR的循環(huán)參數(shù)

 

1.  預(yù)變性（Initial denaturation）

 

模板DNA*變性與PCR酶的*激活對PCR能否成功至關(guān)重要,，建議加熱時(shí)間參考試劑說明書,，一般未修飾的Taq酶激活時(shí)間為兩分鐘。

 

2.  循環(huán)中的變性步驟

 

循環(huán)中一般95℃,，30秒足以使各種靶DNA序列*變性,，可能的情況下可 縮短該步驟時(shí)間，變性時(shí)間過長損害酶活性,，過短靶序列變性不*,，易造成擴(kuò)增失敗。

 

3.  引物退火（Primer annealing）

 

退火溫度需要從多方面去決定,，一般根據(jù)引物的Tm值為參考,，根據(jù)擴(kuò)增的長度適當(dāng)下調(diào)作為退火溫度。然后在此次實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上做出預(yù)估,。

 

退火溫度對PCR的特異性有較大影響,。

 

4.  引物延伸

 

引物延伸一般在72℃進(jìn)行（Taq酶適溫度）。但在擴(kuò)增長度較短且退火溫度較高時(shí),，本步驟可省略

 

延伸時(shí)間隨擴(kuò)增片段長短而定,，一般推薦在1000 bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生設(shè)定為1 min/kbp,。

 

5.  循環(huán)數(shù)

 

大多數(shù)PCR含25-40循環(huán),，過多易產(chǎn)生非特異擴(kuò)增。

 

6.  后延伸

 

在后一個(gè)循環(huán)后，反應(yīng)在72℃維持5-15分鐘．使引物延伸*,，并使單鏈產(chǎn)物退火成雙鏈,。

 

六、PCR步驟

 

1.  DNA變性

 

（90℃-96℃）：雙鏈DNA模板在熱作用下,， 氫鍵斷裂,，形成單鏈DNA。

 

2.  退火

 

（25℃-65℃）：系統(tǒng)溫度降低,，引物與DNA模板結(jié)合,，形成局部雙鏈。

 

3.  延伸

 

（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右,，活性）的作用下,，以dNTP為原料，從引物的5′端→3′端延伸,，合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈,。

 

七、PCR檢測

 

PCR反應(yīng)擴(kuò)增出了高的拷貝數(shù),，下一步檢測就成了關(guān)鍵,。熒光素（溴化乙錠，EB）染色凝膠電泳是常用的檢測手段,。電泳法檢測特異性是不太高的,，因此引物兩聚體等非特異性的雜交體很容易引起誤判。但因?yàn)槠浜喗菀仔?，成為了主流檢測方法,。近年來以熒光探針為代表的檢測方法，有逐漸取代電泳法的趨勢,。

 

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注意事項(xiàng)

1.  由于PCR反應(yīng)靈敏度很高,，因此要特別主意防止DNA污染的發(fā)生。樣品間的相互污染可能產(chǎn)生假陽性結(jié)果,，特別是將PCR技術(shù)應(yīng)用到臨床病原菌感染確定中,。

 

2.  如果是公用的、沒有密碼保護(hù)的PCR儀,，經(jīng)常檢查PCR儀上的程序正確與否,。

 

3.  不使用過量試劑“less is usually better （more specific）”。

 

4.  試劑購回后應(yīng)分裝成小份使用,，這樣一旦有污染發(fā)生,，可以立即丟棄污染的試劑,，不會(huì)造成大的損失,；試劑分裝也有助于減少反復(fù)凍融次數(shù)（例如dNTPs對反復(fù)凍融敏感）。

 

5.  加完所有試劑后用槍頭吹打幾次或稍微渦旋或輕彈管壁以保證充分混勻。

 

6.  使用陰性對照檢查污染的發(fā)生,。

 

7.  使用陽性對照（能良好擴(kuò)增的樣本）,。

 

8.  電泳時(shí)使用DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)品（指示是否PCR失敗或條帶跑出凝膠或拍照系統(tǒng)失敗）,。

 

9.  當(dāng)擴(kuò)增很長的,、GC含量高的模板時(shí)或容易產(chǎn)生二級(jí)結(jié)構(gòu)的模板時(shí)適量使用添加劑（glycerol, formamide, NMP使變性和退火溫度降低幾度；glycerol也可起到穩(wěn)定聚合酶活性的作用,；DMSO 減少二級(jí)結(jié)構(gòu)的發(fā)生,，并通過減弱非特異性引物結(jié)合的穩(wěn)定性，提高反應(yīng)的特異性）,。

 

10.  不使用帶有自動(dòng)除霜功能的冰箱存儲(chǔ)酶（避免反復(fù)凍融）,，每次取酶時(shí)都使用新的槍頭酶，酶使用后應(yīng)立即放回冰箱,。酶要在加完緩沖液后再加,，直接將酶加入水中可能導(dǎo)致酶變性失活。

 

11.   PCR產(chǎn)物的電泳檢測時(shí)間,，一般為48 h以內(nèi),，有些于當(dāng)日電泳檢測，大于48h后帶型不規(guī)則甚致消失,。

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其他

一,、  PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)

 

1.  模板核酸的制備。

 

2.  引物的質(zhì)量與特異性,。

 

3.  酶的質(zhì)量,。

 

4.  PCR循環(huán)條件。

 

二,、 PCR常見問題及對策

 

1.  假陰性,，不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶

 

 

（1）模板原因

 

①  模板中含有雜蛋白質(zhì)。

 

②  模板中含有Taq酶抑制劑,。

 

③  模板中蛋白質(zhì)沒有消 化除凈,，特別是染色體中的組蛋白。

 

④  在提取制備模板時(shí)丟失過多,，或吸入酚,。

 

⑤  模板核酸變性不*。在酶和引物質(zhì)量好時(shí),，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶,，極有可能是標(biāo)本的消化處 理，模板核酸提取過程出了毛病,，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液,，其程序亦應(yīng)固定不宜隨意更改。

 

 

（2）酶失活

 

①  需更換新酶，或新舊兩種酶同時(shí)使用,，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導(dǎo)致假陰性,。

 

 

②  忘加Taq酶或溴乙錠。

 

 

（3）引物

 

 

①  引物質(zhì)量,。

 

 

②  引物的濃度,。

 

 

③  兩條引物的濃度是否對稱。

 

解決對策：

 

①  選定一個(gè)好的引物合成單位,。

 

②  引物的濃度不僅要看OD值,，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn),，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致,，如一條引物有條帶，一條引物無條帶,，此時(shí)做PCR有可能失敗,，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高,，一條亮度低,，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。

 

③  引物應(yīng)高濃度小量分裝保存,，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分,，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。

 

④  引物設(shè)計(jì)不合理,，如引物長度不夠,，引物之間形成二聚體等。

 

 

（4）Mg2+濃度

 

①  濃度過高降低PCR擴(kuò)增的特異性,。

 

 

②  濃度過低影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶,。

 

 

（5）反應(yīng)體積的改變

 

①  通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20 ul、30 ul,、50 ul或100 ul,，應(yīng)用多大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設(shè)定;

 

②  在做小體積如20 ul 后,，再做大體積時(shí),，一定要模索條件，否則容易失敗,。

 

 

（6）物理原因

 

①  變性對PCR擴(kuò)增來說相當(dāng)重要,，如變性溫度低，變性時(shí)間短,，極有可能出現(xiàn)假陰性,。

 

②  退火溫度過低,，可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率；退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率,。

 

③  擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度有問題,。

 

 

（7）靶序列變異

 

①  靶序列發(fā)生突變或缺失,，影響引物與模板特異性結(jié)合。

 

②  靶序列某段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列,。

 

 

2.  假陽性,，出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致，有時(shí)其條帶更整齊,，亮度更高,。

（1）引物設(shè)計(jì)不合適

 

①  選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性。

 

②  靶序列太短或引物太短,。

（2）靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染

 

①  整個(gè)基因組或大片段的交叉污染,。

 

解決方案：操作時(shí)應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外,。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外,，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用,。必要時(shí),，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射,，以破壞存在的核酸,。

 

②  空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短,，但有一定的同源性,。可互相拼接,，與引物互補(bǔ)后,，可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生,。

 

解決方案：可用巢式PCR方法來減輕或消除,。

3.  出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增：PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致，或大或小,，或者同時(shí)出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶,。

 

（1）  引物與靶序列不*互補(bǔ)或引物聚合形成二聚體。

 

（2） Mg2+離子濃度過高,。

 

（3） 退火溫度過低,。

（4） PCR循環(huán)次數(shù) 過多有關(guān),。

 

（5） 酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn),，酶量過多有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增,。

 

其對策有：必要時(shí)重新設(shè)計(jì)引 物。減低酶量或調(diào)換另一來源的酶,。降低引物量,，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次 數(shù),。適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法（93℃變性,，65℃左右退火與延伸）。

4.  出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶

（1）原因

 

①  酶量過多,。

 

②  酶的質(zhì)量差,。

 

③  dNTP濃度過高。

④  Mg2+濃度過高,。

 

⑤  退火溫度過低,。

 

⑥  循環(huán)次數(shù)過多引起。

 

（2）對策

 

① 減少酶量,。

 

②  調(diào)換另一來源的酶,。

 

③  減少dNTP的濃度。

 

④  適當(dāng)降低Mg2+濃度,。

 

⑤  增加模板量,。

 

⑥  減少循環(huán)次數(shù)。