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技術(shù)文章
細(xì)胞電融合
閱讀：638 發(fā)布時間：2019-1-3實驗方法原理 將制備的游離細(xì)胞或原生質(zhì)體,，置于電融合室中,，在高頻交流電場的作用下，細(xì)胞被極化,，成為偶極子,，造成細(xì)胞之間相互連接，如果施加的高頻交流電壓(即正弦波的p-p值)過高或作用時間過長,，則細(xì)胞連接成串珠狀,，應(yīng)適當(dāng)控制以上條件，盡量使兩細(xì)胞處于點接觸狀態(tài),，然后施加方波脈沖予以刺激,，由于電脈沖的瞬間作用，可擊破兩細(xì)胞接觸點部位的質(zhì)膜,，此時質(zhì)膜的脂類分子發(fā)生重組,，同時由于細(xì)胞表面的張力作用,，使兩細(xì)胞融合逐步*。
實驗材料 動物游離細(xì)胞植物原生質(zhì)體
試劑,、試劑盒 甘露醇氧化鈉纖罐索醇離析酶蝸牛酶CaCl2MES (2-N-嗎啉乙烷磺酸)葡聚糖硫酸鉀
儀器,、耗材 JCF-I型細(xì)胞電融合儀細(xì)胞融合池普通離心機倒置顯微鏡(或研究用顯微鏡)刻度吸管不銹鋼網(wǎng)(200目)鑷子解剖刀解剖剪注射器毛細(xì)吸智刻度吸蕾
實驗步驟
一、植物原生質(zhì)體的制備
1,、取幼嫩的葉片或充分展開的子葉,，先用水洗凈并吸去表面的水份，再置入小燒杯中將葉片剪成碎塊,。
2,、將碎塊放入1.5％纖維素酶、0.3％離析酶,、0.5％蝸牛酶、0.6mol/L甘露醇,、50mmol/L CaCl2·2H20,、MES 3mmol/L、葡聚糖硫酸鉀0.3％,，pH5.6的酶液中,，置于25℃暗處游離5h（或15℃過液），游離時間結(jié)束時,，可鏡檢原生質(zhì)體分離情況,，如果大多數(shù)原生質(zhì)體還未從組織中釋放出來，需增加在酶液中的游離 時間,。新出廠的酵在5h內(nèi)一般就可將原生質(zhì)體游離出來,，但因藥品質(zhì)量問題或存放時間過長，致使酶活力下降,，要適當(dāng)延長酶解時間,。
3、將醇解出來的原生質(zhì)體用不銹鑰網(wǎng)過濾,，以除去未被酶解的組織,，過濾后用0.6M的蔗糖沖洗網(wǎng)上殘留的原生質(zhì)體，然后以200r/min進(jìn)行離心處理5min,。
4,、用帶長針頭的注射器吸去上清液，然后加入1—1.5ml 0.2mol/L的CaCl·2H2O,，將原生質(zhì)體混勻,。
5、用細(xì)頭滴管或帶長針頭的注射器向管底慢慢注入20％的蔗糖液,，再以300r/min離心10min,，此時可見到在上下兩液體間的界面處有一層乳白質(zhì)的帶狀物,，即為純凈的原生質(zhì)體，其破碎的部份及其它雜質(zhì)都沉降到離心管底部,，用長針頭注射器或毛細(xì)吸臂分別吸去管底的雜質(zhì)和蔗蔗糖液以及原生質(zhì)體上層的 CaCl2液,。
6、向離心管加入2ml 0.2mol/L的CaCl·2H2O溶液,，混勻后以300r/min離心5min去掉上清液,，量后用0.6mol/L的甘露醇溶液稀釋并調(diào)整每毫升含5×104個原生質(zhì)體。
二,、動物細(xì)胞的制備
用滅菌的注射器先吸入Alsver液（葡萄糖2.05g,，枸椽酸鈉0.88，NaCl0.42g,，加重蒸水至100ml）lml,，再從雞的翼下靜脈取血0.5--1ml，取出后放入刻度離心管中,，再加入2--3ml Alsver液,，使總量為4--5ml，混勻并封口,，置于4℃冰箱內(nèi)可供一周內(nèi)使用,，實驗時取貯備的雞血細(xì)胞lml，加入4ml85％生理鹽水,，混勻后以1200rr/min離心5min,，去上清液后，后用0.6mol/L的甘露醇液（或0.6mol/L蔗糖溶液）混勻后以上述離心條件洗滌兩次,，后用0.6mol/L的甘露醇液將雞細(xì)胞稀釋并調(diào)整成每毫升含2×105個,。
如采用傳代培養(yǎng)的骨髓或腹水瘤細(xì)胞，可先用0.9％的生理鹽水洗滌兩次,，離心速度為800--1000r/min,，每次5min，再用0.6mol/L的甘露醇或蔗糖液洗滌兩次,，每次600--800r/min,，離心5min，后用甘露醇調(diào)整成每毫升含瘤細(xì)胞1×105個,。
三,、細(xì)胞電融合方法
1、儀2S結(jié)構(gòu)和使用方法
JCF-型細(xì)胞電融事儀的各項技術(shù)參數(shù)是通過大量的融合實驗數(shù)據(jù),，并參考島津公司（日）SSH型電融合裝置的參數(shù)值而設(shè)計的,。當(dāng)打開電源，指示燈亮，并撥通輸出開關(guān)和正弦輸出開關(guān),，選擇和按下正弦頻率按鍵（共分為0.6,、0.8、1.3,、1.5MHz五檔）,，此時將輸出電纜與示波器相接，在示波器上即出現(xiàn)高頻正弦波形,，當(dāng)左右旋轉(zhuǎn)正弦幅度旋鈕,，則正弦電壓的p-p值，也隨之降低和升高,，如果將輸出電纜與電融合室相接,，則細(xì)胸相互連接。此時再旋動正弦幅度（即正弦電壓）旋扭,，則儀器上電壓表指針隨之升高和降低,。如果正弦電壓過高，則細(xì)胞連接速度加快,，并呈串珠狀,，不利于兩細(xì)胞融合。
將正弦輸出開關(guān)搬至“復(fù)合輸出”檔,，根據(jù)所需功率大小選拔復(fù)合輸出I或、II檔,、I檔為低功率,，II檔為高功率；再根據(jù)實驗要求,，選擇并按下你所需要的“脈沖寬度”撥鍵（分1ms,，0.2ms、0.1ms,、10ms,、1us五檔）和“脈沖幅度”按鍵（50V、100V,、150V,、200V、250V五檔）,，還配有脈沖幅度旋扭（細(xì)調(diào)）,，調(diào)整范圍0-50V，可使每檔增值50V,。
施加脈沖刺激可分為“自控”和“手控”兩檔,，當(dāng)使用“自控”輸出脈沖時，先將開關(guān)搬向自控檔,，然后根據(jù)需要選擇并按下“脈沖頻率按健”（分為2sl次及每秒1次,、2次,、5次、l0次共五檔）,，即可自動發(fā)送電脈沖,；如果將開關(guān)搬至“手控”檔，需按動“手控”按扭,，每按動一次發(fā)送一個脈沖,。無論自控或手控輸出，每個脈沖輸出都伴有報鳴音響,，將輸出端與脈沖示波器連接,，則可觀察到由脈沖寬度、幅度及脈沖間隔所構(gòu)成的示波圖像,，當(dāng)改變以上有關(guān)參數(shù)值時,，其圖像亦發(fā)生變化：把開關(guān)搬向反向，則產(chǎn)生負(fù)脈沖,，當(dāng)脈寬和幅度等值不變時,，其圖像與正脈沖波形相同，但方面相反,，上下對稱,。將電纜輸出端與電融合室的兩電極相接，并按上述要求發(fā)送一定方波脈沖,，細(xì)胞受到電刺激后,，可產(chǎn)生融合。
2,、電融合操作
植物原生質(zhì)體融合
開啟電源,，關(guān)閉“輸出開關(guān)”，將開關(guān)搬向正弦輸出檔,，此時可根據(jù)實驗需要,，將正弦額度選擇在1—1.3MHz，脈沖寬度為0.1ms或）10μs,，脈沖幅度為150V,，脈沖頻率為1次/s，并依次按下各標(biāo)定按鍵,，后調(diào)整正弦電壓（即正弦幅度）旋扭,，使電壓表處于5-10V處。
收起
注意事項
在現(xiàn)有細(xì)胞電融合方法中需要解決的問題主要有： 細(xì)胞融合通量低; 融合細(xì)胞的存活率較低; 細(xì)胞電融合過程尚達(dá)不到可視化要求,。
微電極陣列的使用既可以提高細(xì)胞電融合的有效率,， 又可以提高細(xì)胞融合時的通量， 因此也成為細(xì)胞電融合過程發(fā)展的必然趨勢; 同時， 提高圖像數(shù)據(jù)采集速率; 使用圖更加集成化的像處理軟件功能以及采用像PDMS,、玻璃這類透明介質(zhì)來制作融合芯片就不會受到光照強度的影響,， 可以大大提升圖像質(zhì)量也為了解細(xì)胞融合的細(xì)微過程提供了必要的前提條件。
其他
在用電脈沖融合前必須使細(xì)胞相互緊密接觸,，這一電融合方法在原生質(zhì)融合制取雜交植物,，胚胎細(xì)胞相互融合制備動物克隆方面非常有用，尤其在制取雜交瘤細(xì)胞制備單克隆抗體方面用處很大,。幾個實驗室已證明使用電場電融合效率比常規(guī)的化學(xué)融合方法高10到100倍,，近，貼壁細(xì)胞的電融合還被用來研究細(xì)胞融合時細(xì)胞的骨架成分和細(xì)胞器的動力學(xué)重排,。
來源于《細(xì)胞電融合以及進(jìn)展》中國生物工程雜志,。