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減毒的復(fù)制缺陷痘苗病毒 Ankara（MVA）,，作為標(biāo)準(zhǔn)痘苗病毒株的替代物,，可以作為載體表達(dá)外源蛋白,。MVA 是痘苗病毒 Ankara 在雞胚成纖維細(xì)胞中通過(guò)多次傳代（>570 次）得到的,。盡管MVA可以表達(dá)重組蛋白,，但其在人類和大部分哺乳動(dòng)物細(xì)胞中不能包裝成具有感染能力的病毒顆粒，因此需制備專門用于培養(yǎng) MVA 的雞胚成纖維細(xì)胞,。
本實(shí)驗(yàn)主要介紹雞胚成纖維細(xì)胞的制備,。
實(shí)驗(yàn)方法原理    
用雞胚制備培養(yǎng)雞胚成纖維細(xì)胞。
實(shí)驗(yàn)材料    9 日齡雞胚
試劑,、試劑盒    70% 乙醇胰酶／EDTA無(wú)添加 MEM 培養(yǎng)基* MEM-10 培養(yǎng)基
儀器,、耗材    無(wú)菌解剖剪無(wú)菌鑷子100 cm2 無(wú)菌培養(yǎng)皿10 ml 注射器無(wú)菌胰酶消化瓶（帶磁力攪拌棒）CO2 培養(yǎng)箱500 ml 燒杯紗布 Sorvall 離心機(jī)250 ml 離心管150 cm2 組織培養(yǎng)瓶
實(shí)驗(yàn)步驟    
1. 將 10 只 9 日齡雞胚有空氣部分朝上放置，噴上 70% 乙醇,。

2. 用無(wú)菌的解剖剪將雞蛋的頂部打開,，剪掉膜上蛋殼，使膜保持完整,。用無(wú)菌鑷子將膜取掉,。其他雞蛋亦重復(fù)相同操作。

3. 取出雞胚,，放入無(wú)菌的 100 cm2 培養(yǎng)皿,。

4. 剪掉每個(gè)雞胚的頭和足，將剩余的身體放入無(wú)菌的 100 cm2 平皿中,，加入 10 ml 無(wú)添加劑的 MEM 培養(yǎng)基,。通過(guò) 10 ml 注射器（5 個(gè)雞胚/注射器）擠壓，將雞胚切碎并打人無(wú)菌的胰酶消化瓶中,。

5. 加入 100 ml 37℃ 的胰酶/EDTA,，并在加濕的 5% CO2 培養(yǎng)箱中 37℃ 持續(xù)攪拌溫育 5 min,。

6. 將液體從無(wú)菌胰酶消化瓶中倒人杯口帶兩層紗布的 500 ml 燒杯，將過(guò)濾后的液體轉(zhuǎn)移至 250 ml 離心瓶中,。

7. 向含有剩余組織的無(wú)菌胰酶消化瓶中加入 100 ml 新鮮的胰酶/EDTA,，37℃ 溫育。

8. 將消化液倒入另一個(gè)杯口帶兩層紗布的 500 ml 燒杯,，并將過(guò)濾后的液體加入先前的 250 ml 離心瓶中。

9. 在 Sorvall RC-3B 離心機(jī)中,，4℃,，1200 g 離心 10 min。

10. 丟棄上清,，加入 10 ml MEM-10 *培養(yǎng)基,，反復(fù)抽吸 10～15 次重懸沉淀，并將體積調(diào)整至 100 ml,。

11. 將懸液轉(zhuǎn)移至 250 ml 離心瓶中,，4℃，1200 g 離心 10 min,。

12. 用 5 ml MEM-10 *培養(yǎng)基重懸沉淀,，并將體積調(diào)整至 30 ml。

13. 將細(xì)胞懸液按每瓶 1 ml 加入到 30 個(gè)含有 30 ml MEM-10 *培養(yǎng)基的 150 cm2 組織培養(yǎng)瓶中,。

14. 37℃ 培養(yǎng)幾天直至細(xì)胞長(zhǎng)滿,，然后將培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移至加濕的 5% CO2 培養(yǎng)箱中 31℃ 保存。

CEF 細(xì)胞培養(yǎng)液能夠在 31℃ 保存 2～3 個(gè)星期,。原代的 CEF 細(xì)胞也能直接用于病毒生長(zhǎng),，或?qū)⒁让柑幚砗蟮?CEF 細(xì)胞凍存在液氮中留以后使用。