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新生大鼠心臟細胞的分離和培養(yǎng)實驗
閱讀：338 發(fā)布時間：2018-12-29實驗材料 Sprague Dawley 幼鼠
試劑、試劑盒 胰酶液乙醇
儀器,、耗材 攪拌臺燒杯
實驗步驟
組織消化和分離細胞
1. 在細胞操作間內,，放一個加熱攪拌臺，上放一個裝有 100 ml 滅菌水的容量 600 ml 的燒杯,，加熱至 37℃,。
2. 準備胰酶液。用水浴或溫箱使胰酶液溫度保持在 37℃,。
3. 做一個冰臺：將一只平皿裝滿冰后倒置即可,，70% 乙醇擦拭平皿后放進操作臺。取 3 個 60 mm 的一次性組織培養(yǎng)用平皿,，加入 5 ml 鹽水 A,，標記上 1，2,3 放進操作臺的冰臺上,。
4. 取一只干凈加蓋的燒杯,，內放一塊 Metofane 飽和的紗布，把 0~1 日齡的 Sprague Dawley 幼鼠放進該燒杯中麻醉,。20 只 幼鼠大約需要 5 分鐘時間,。用 70% 乙醇擦凈燒杯再放進操作間。
5. 一次取出一只幼鼠,，一定要再蓋好蓋子,，然后將幼鼠躺著放在一塊無菌紗布上，用乙醇擦洗其胸部及腹部,。把鼠肩胛骨往后夾,，使突出胸腔，在肋骨下沿胸骨方向拉一口,，摘出心臟放進標記著 1 的培養(yǎng)皿中,。
6. 繼續(xù)處理余下的幼鼠，一定要保持手套及所用器械潔凈,，每次解剖約需 1 分鐘,。
7. 上述操作完成后，用兩把 5 號鉗子剔除心臟上結締組織再轉入標記為 2 的培養(yǎng)皿中,。再洗一遍,，轉入標記為 3 平皿中。
8. 取一只無菌巴斯德吸管輕輕把平皿 3 中的鹽水液 A 吸出,，然后加入 2 ml 孵育過的胰酶液,。用準備好的第二把無菌解剖刀把心臟切碎成沙粒大小。
9. 把上述切碎的心臟及胰酶液轉入加了攪拌子的錐形瓶中,。另外吸取 3 ml 新鮮的胰酶沖洗平皿和剪刀并轉入錐形瓶,，補加胰酶至終體積 10 ml，加上塞子，放入 37℃ 水浴中,。打開攪拌器,，調節(jié)轉速至 60 r/min 左右，消化 15 分鐘,。
10. 從水浴中拿出錐形瓶,，小心吸去上清，上清中的主要成分是血紅細胞,，加入 10 ml 新的胰酶,，37℃ 水浴再作用 15 分鐘。
11. 棄上清,。加入 10 ml 新的胰酶,，用一支一次性帶刻度的吸管吹打溶液兩次，機械分散細胞,，再孵育 10 分鐘,。
12. 上述消化處理的同時，往一支 50 ml 的一次性無菌錐形管中加入 10 ml 冷的接種培養(yǎng)基,。
培養(yǎng)已分離出的細胞
13. 消化處理之后,，小心移出上清至上述加有接種培養(yǎng)基的錐形管中，這就是次收集到的分離出的細胞,。余下的組織塊中加入 10 ml 新胰酶繼續(xù)消化,。
14. 消化的同時，上述含培養(yǎng)基和細胞上清的錐形管以 1200 r/min 離心 4 分鐘,。輕輕吸去上清,，加 5 ml 接種培養(yǎng)基重新懸浮細胞團。
15. 重復 11~14 步驟 9 次,，或直至只剩余少許組織塊為止,。將所用細胞懸液集中于一支錐形管中。
16. 后一次沉淀細胞,，加接種培養(yǎng)基至 10 ml,，吹打幾次以散開所有細胞團。
17. 將上述 10 ml 懸液轉移到 100 mm 規(guī)格的無菌組織培養(yǎng)平皿中,，于 5% CO2,，高濕度的 37℃ 溫箱中放置 1~1.5 小時，目的是減少成纖維細胞的污染,。
18. 孵育后,，收集所有平皿中的培養(yǎng)液,，培養(yǎng)液中包含非貼壁細胞,，每個平皿用 10 ml 預溫的接種培養(yǎng)液沖刷后收集。量一量后收集溶液的體積，用臺盼藍拒染法計數(shù)細胞,。一般地,，總細胞數(shù)在 5X107~1X108 間，成活率約 85%,。
19. 用接種培養(yǎng)基將細胞密度調整至 5X105~6X105 細胞/ml,，制成接種液。
20. 每只 35 mm 規(guī)格平皿加 2 ml 上述接種液,，60 mm 規(guī)格的平皿加 5 ml 的接種液,，孵育 4~6 小時。
21. 4~6 小時后,，用培養(yǎng)基或鹽水液 A 輕輕洗涮平皿兩次,，倒掉，加入交換培養(yǎng)基繼續(xù)孵育過夜,。
22. 用培養(yǎng)基或鹽水 A 沖洗平皿兩次,，加入新配制的交換培養(yǎng)基，繼續(xù)溫育,，兩天換一次液,。