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實驗方法原理    
實驗材料    待標記的培養(yǎng)細胞
試劑,、試劑盒    37℃標記培養(yǎng)液1 Ci／ml H3(32)PO4(溶于 HCl)冰冷 Tris 平衡鹽水(TBS) ／磷酸鹽平衡鹽水(PBS)溫和裂解緩沖液／RIPA 裂解緩沖液
儀器,、耗材    樹脂玻璃擋板(1 in 厚)取液器吸頭樹脂玻璃盒37℃微量離心管一次性吸管 橡皮細胞刮子Sorvall 冷凍離心機(或其他)樹脂玻璃薄板／4℃ 樹脂玻璃管架
實驗步驟    
實驗試劑儀器的具體要求見「其他」。

1. 培養(yǎng)待標記的細胞至適當?shù)纳L期,。
生長旺盛的細胞中磷酸鹽轉(zhuǎn)運達到高峰,，除非研究靜止期細胞的蛋白質(zhì)磷酸化，一般待標記的細胞生長密度不要達到匯片,，標記前 3～18 h 換新鮮的培養(yǎng)液培養(yǎng)將有利于標記,。

2. 吸去培養(yǎng)液，用 37℃ 的含血清不加標記物的標記培養(yǎng)液洗盡殘存的含磷酸鹽的培養(yǎng)液,，吸盡該培養(yǎng)液,。

3. 加入預熱的標記培養(yǎng)液，加入量為：（0.5～1 ml）/35 mm 培養(yǎng)皿,，（1～2 ml）/50 mm 培養(yǎng)皿,，或（2～4 ml）/100 mm 培養(yǎng)皿。

4. 在樹脂玻璃擋板后操作,，使用配備塞有棉花防浮質(zhì)吸管的微量移液器加入 32P 至終濃度為 0.1～2 mCi/ml,。
標記 1～2 h 已足夠，但細胞可在 6 h 內(nèi)耐受高達 2 mCi/ml 和在 18 h 內(nèi)耐受低濃度（0.1～0.5 mCi/ml）的輻射,。

5. 將培養(yǎng)皿置于預熱的樹脂玻璃盒中,，并將盒子置于培養(yǎng)箱中。

6. 標記結(jié)束時,，將裝有標記細胞的樹脂玻璃盒移至冷室,，放在樹脂玻璃擋板后面。

7. 從樹脂玻璃盒子中取出培養(yǎng)皿,，用一次性的移液管吸盡標記培養(yǎng)液,，培養(yǎng)液和吸頭或吸管均作為同位素廢物棄置。

8. 用 2～10 ml 冷 TBS 洗滌細胞 2 次,，同步驟 7 一樣吸盡并棄去放射性廢物,。

9. 加適量裂解緩沖液（0.3 ml/35 mm 培養(yǎng)皿，0.6 ml/50 mm 培養(yǎng)皿或 1.0 ml/ 100 mm 培養(yǎng)皿）,，用橡皮細胞刮子擦刮下貼壁細胞,，裂解物留在培養(yǎng)皿上,，4℃ 放置 20 min,。用橡皮細胞刮子將貼壁細胞的裂解液移至培養(yǎng)皿邊緣，并將裂解液移入帶螺口蓋的微量離心管中,。

10. 蓋上管蓋,，于 4℃ 26000 g 離心 30 min 澄清裂解液,。

11. 離心后，將上清（裂解物）移至新離心管中,，離心管和沉淀作為同位素污物處理,。

12. 用凝膠電泳、免疫沉淀或蛋白質(zhì)純化方法,，分析標記的裂解液,，所有過程均在4℃ 適當屏蔽下進行。
收起 
注意事項    
1. 除非特別說明,，細胞培養(yǎng)在加濕的 37℃,，10% CO2 培養(yǎng)箱中進行。

2. 步驟 7 中,，不能用真空泵吸標記培養(yǎng)液,。真空泵抽吸會產(chǎn)生放射性氣溶膠并在儀器中留下放射性薄層。繼續(xù) Plexiglas 擋板后處理細胞和裂解,。

3. 步驟 9 中,，如果需要降低由非特異性雜質(zhì)造成非特異性的背景，可使用 RIPA 裂解緩沖液,。如果要求保持酶 的活性或蛋白質(zhì)復合物的結(jié)構(gòu),，使用含 CHAPS （3-膽酰胺丙基-二乙胺丙磺酚）或 Nonidet P-40 （乙基苯基聚二乙醇，即 NP-40）作為去污劑的溫和裂解緩沖液,。要*溶解細胞和使蛋白質(zhì)變性,，使用SDS裂解方法。

4. 步驟 10 中管內(nèi)液體是裝至半滿以防液體濺出,。
用 RIPA 緩沖液制備裂解液時,，由于細胞核的溶解常導致細胞裂解液變得黏稠。當發(fā)生這種情況 時,，延長離心時間到 90 min,，或離心前在 RIPA 液中加入 50 μl 固相化金黃色葡萄球菌，都可使 DNA 沉于管底,。
收起 
其他    
試劑：
標記培養(yǎng)液：不含磷酸鹽的細胞培養(yǎng)液 （如 DMEM）,，添加了常規(guī)濃度的血清或用無磷酸鹽的鹽水透析過的血清，37℃
溶于 HCl 中的 1 Ci/ml H332PO4 （無載體,，ICN）
Tris 平衡鹽水（TBS） 或磷酸鹽平衡鹽水（PBS）,，冰冷
溫和裂解緩沖液或 RIPA 裂解緩沖液

儀器：
1 in 厚的樹脂玻璃擋板
塞有濾芯的防浮質(zhì)的取液器吸頭
樹脂玻璃盒，預熱到 37℃
帶螺口蓋的微量離心管
一次性的吸管（塞有棉花）
橡皮細胞刮子
Sorvall 冷凍離心機,，帶 SM 24 轉(zhuǎn)子和橡皮套管,，或其他相當?shù)睦鋬鲭x心機，4℃
樹脂玻璃薄板 （10 in × 10 in × 1/4 in） 或樹脂玻璃管架,，4℃