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從石蠟包埋固定的組織中制備 RNA 實(shí)驗(yàn)
閱讀：419 發(fā)布時(shí)間：2018-12-28實(shí)驗(yàn)材料 石蠟包埋的組織樣品
試劑、試劑盒 甲酰胺消化緩沖液乙醇肝糖異丙醇苯酚 蛋白酶 KTrizol二甲苯
儀器,、耗材 微量離心管恒溫箱
實(shí)驗(yàn)步驟
一,、材料
1. 緩沖液、溶液和試劑
去離子化的甲酰胺
焦碳酸二乙酯（DEPC) 處理過的水
消化緩沖液（lmol/L 異硫氰酸胍,25 mmol/Lβ-巰基乙醇,，0.5%N-月桂酰肌氨酸,，20 mmol/LTris-HCl，pH7.5)
乙醇,100% 和 70%
肝糖
異丙醇
苯酚 (pH4.3): （70%:30%)
蛋白酶 K(60 mg/ml,，20U/mg)
Trizol(Invitrogen)
二甲苯
2. 特殊設(shè)備
微量離心管,，2 ml, 無 RNA 酶
恒溫箱，預(yù)調(diào)至 37°C
水浴或恒溫箱,，預(yù)調(diào)至 55°C
3. 細(xì)胞和組織
石蠟包埋的組織樣品,，切割為 5~50 張 5um 厚的切片
二、方法
1. 將組織塊置于 2.0 ml 微量離心管中，向樣品中加 1.8 ml 二甲苯,。37°C 溫育 20 min,。
2. 稍微地離心樣品，移棄上清液再加入二甲苯,，重復(fù)溫育和離心步驟,。
3. 用 0.5 ml 乙酵洗滌組織。移棄乙醇,，風(fēng)干,。
4. 加 80ul 蛋白酶 K(60 mg/ml，20U/mg) 和 72ul 消化緩沖液,。55°C 下振蕩溫育過夜,。
5. 再次加 80ul 蛋白酶 K，55°C 下振蕩溫育過夜,。次日再次加 80ul 蛋白酶 K, 再次 55°C下振蕩溫育過夜,。
6. 加等體積酚：混合，在微量離心機(jī)中以大轉(zhuǎn)速離心 5 min,。將液相轉(zhuǎn)移到RNA 酶的新管中。
7. 加等體積異丙醇和 2ug 肝糖,，-20°C 放置 30 min,。
8. 在微董離心機(jī)中以大轉(zhuǎn)速離心 30 min。移棄上清液,，用 70% 乙酵洗滌沉降物,。
9. 在微量離心機(jī)中以大轉(zhuǎn)速離心 30 min 并移棄上清液。風(fēng)干沉降物,，將之再溶解20ulDEPC 處理過的水中,。加 500ulTrizol。遵循 Trizol 方案（見本章方案 3),，對(duì)一處做修改：在次 Trizol 處理后,，將液相轉(zhuǎn)移到無 RNA 酶的新管中，用 500ulTrizol 第二次處理樣品,。
10. 向第二次 Trizol 處理過的液相加 500ul 異丙醇以沉淀 RNA,。
11. 將 RNA 沉降物再溶解于 20ul 去離子甲酰胺中。-20°C 儲(chǔ)存 RNA,。